赖氨酸的测定

---

方法一：三硝基苯磺酸法测定赖氨酸含量

赖氨酸是必需氨基酸之一，食品及饲料的质量高低，与其蛋白质中赖氨酸含量的多少密切相关。

由于三硝基苯磺酸(TNBS)只与蛋白质中N－末端的α－氨基及赖氨酸残基的ε－氨基起反应，反应后所生成的TNP－蛋白质经部分酸水解后，分别产生含有α-TNP－氨基及ε－TNP－氨基的小肽碎片，在酸性溶液中α－TNP－氨基可用有机溶剂抽提除去，而留下的ε－TNP－氨基含量即可在波长340nm处定量测定，此含量即相当于蛋白质中赖氨酸的含量。

试剂

(1)4%碳酸氢钠溶液：称4克碳酸氢钠加蒸馏水至100毫升。

(2)50%三氯乙酸溶液：称50克三氯乙酸用蒸馏水定容至100毫升。

(3)5%三氯乙酸溶液：5克三氯乙酸用蒸馏水定容至100毫升。

(4)0．1%三硝基苯磺酸溶液：0．1克三硝基苯磺酸加蒸馏水至100毫升，贮于棕色瓶中。

(5)6N HCl溶液。

(6)1N HCl溶液。

(7)丙酮。

(8)乙醚。

(9)标准溶液：标准溶液应用ε－TNP－赖氨酸，但ε-TNP－赖氨酸来源困难。也可用其他氨基酸代替，这是因为不同种类的TNP－氨基酸在340毫微米处的吸收值一致，可用其他氨基酸代替。本实验用ε-TNP－赖氨酸或丙氨酸。

ε－TNP－赖氨酸标准溶液或丙氨酸标准溶液的配制：精确称取丙氨酸2．85克溶解在100毫升水中，便成0．5mM的水溶液。(或配成0．5mMε－TNP－赖氨酸水溶液)。

操作步骤

1．标准曲线的制作：取5支试管，编号，分别加入0．5mM丙氨酸标准溶液0．1，0．2，0．4，0．6，0．8毫升(相当于0．05，0．1，0．2，0．3，0．4微克分子氨基酸)。补充加蒸馏水至1毫升，再加4%NaHCO₃1毫升，0．1%TNBS溶液1毫升，于40℃保温2小时，加1毫升1NHCl混合后，在340nm测定(以蒸馏水作空白)。

以丙氨酸微克分子数(即相当于赖氨酸微克分子数)为横坐标，O、D值(光密度)为纵坐标绘制标准曲线。

2．面粉中赖氨酸含量的测定

(1)面粉用过量20倍的丙酮脱脂两次，再用乙醚处理脱脂后，于60℃水浴中除去残留的乙醚。

取脱脂干燥的面粉0．2克于离心管内，加2毫升4%NaHCO₃，不断用玻棒搅拌抽提数小时，3000转／分，离心后(保留提取液)，再用2毫升4%NaHCO₃抽提三次，合并抽提液。加5毫克固体三硝基苯磺酸、于40℃保温2小时。反应后用50%三氯乙酸酸化，使TNP－蛋白质沉淀完全。离心去上清液，沉淀用5%三氯乙酸洗涤5次，丙酮洗涤5次，倾去洗涤液，干燥后得TNP－蛋白质。

在TNP－蛋白质中加入6N盐酸2．5毫升，封口，于110℃水解2小时，后将水解液置分液漏斗中加蒸馏水12毫升，用8毫升乙醚抽提4～5次，取水相在60℃水浴除去残留乙醚、最后取3毫升(重复2份)加蒸馏水1毫升，在340毫微米测光密度值(以水作空白)。

(2)计算：

式中：A：测定液中赖氨酸的微克分子(由标准曲线查得)；

W：样品重(克)；

146．2：赖氨酸分子量；

12：样品液体积(毫升)；

3：样品测定液体积；

10⁶：换算克为微克的系数；

100：换算为百分含量；

〔注〕①当TNP－蛋白质在6NHCl中水解时，为避免TNP－基团本身的破坏、水解时间不宜过长，一般在110℃2小时即可。因为ε-TNP-小肽在340nm处的光吸收值与游离ε-TNP－赖氨酸的值大致相当，酸水解可不必彻底。

②本法也可测定纯蛋白质中ε－氨基的含量。测定时在碱性条件下保温数小时，使蛋白质变性，否则ε－氨基由于埋在分子内部，与TNBS反应有可能不完全。同时在此条件下，巯基也将氧化成二硫键，可以避免巯基的干扰。

方法二：茚三酮法测定赖氨酸含量

谷物籽粒蛋白质分子中的赖氨酸残基ε－NH₂基与茚三酮试剂反应，生成紫红色物质，在515～525nm下比色，可作赖氨酸的定量测定。该法不需要预先水解蛋白质，在一定条件下、赖氨酸的ε－氨基与茚三酮反应形成有色物质。进行比色测定。方法简便、快速、不需复杂仪器，适合筛选大量样品，应用价值广泛。

由于亮氨酸有一个NH₂基相当于蛋白质上赖氨酸的ε－NH₂基，故用亮氨酸制备标准曲线来测定蛋白质中赖氨酸的含量。

试剂

(1)缓冲液：称30克甲酸钠，溶于50～60毫升水中，再加入10毫升88%的甲酸，最后用蒸馏水定容至100毫升。

(2)4%碳酸钠溶液100毫升。

(3)2%碳酸钠溶液100毫升。

(4)茚三酮试剂：1克茚三酮和2克氯化镉放入棕色瓶中，加25毫升上述缓冲液和75毫升乙二醇，室温下放置一天后使用，如出现沉淀则须过滤．试剂在室温下使用两天。

(5)亮氨酸标准溶液：称25毫克亮氨酸，加数滴稀盐酸待溶解后，用蒸馏水定容至50毫升，浓度为500微克／毫升。再分别吸取2、4、6、8、10、12毫升上述母液，于25毫升容量瓶中，加蒸馏水至刻度。

操作步骤

1．标准曲线的制备：准确吸取上述已配好的标准亮氨酸溶液各0．5毫升，分别放入6支试管中，另取1试管加0．5毫升蒸馏水作空白，每支试管各加入0．5毫升4%Na₂CO₃及2毫升茚三酮试剂，混匀，在80℃水浴中保温30分钟。取出，于冷水中流水冷却3分钟，然后，每支试管各加10毫升1∶1的95%乙醇，摇匀，在515nm下比色，以空白作对照，读取光密度值，绘制标准曲线。

2．样品测定：称取干燥，磨细，通过60目筛的样品(油料籽粒须脱脂)25毫克放入250毫克石英砂及1毫升2%的碳酸钠中，用圆头玻璃棒充分搅拌，研磨2分钟，移至试管，然后放80℃恒温水浴中提取10分钟，取出试管，各管依次加入2毫升茚三酮试剂，摇匀，在80℃水浴中保温30分钟。显色后取出，放入冷水中冷却3分钟，每管各加10毫升1∶1的95%乙醇，过滤，在515nm下比色，读取光密度值，在相同条件下以不加样品的空白作对照。

3．计算：

由亮氨酸标准曲线查得值代入下式，即可求出赖氨酸占样品的百分含量。

式中：L：由曲线查得亮氨酸的微克数，

W：样品重(克)

1．11：由赖氨酸与亮氨酸分子量之比求出的换算系数。

A：样品中的游离氨基态氮的量。

主要谷物中游离氨基态氮的量(A)为：

小麦：0．05%。水稻：0．01%。高粱：0．04%。玉米：0．1%。

100：换算为百分含量

10⁶；换算克为微克的系数。