胰凝乳蛋白酶的测定(分光光度法)

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胰凝乳蛋白酶是一种主要的蛋白水解酶。它能催化水解L－酪氨酸，L－苯丙氨酸，L－色氨酸的羧基所形成的肽键，同时也能作用于酰胺类化合物和某些酯类。催化活性按下述顺序递降：酯类＞酰胺类＞蛋白质。

酶液在pH3、4℃条件下可保存几天。冷冻干燥的酶制剂在4℃下可保存数年之久。

试剂

(1)N－乙酰－L－酪氨酸乙酯(ATEE)－0．05M，pH7．0磷酸盐缓冲液：每毫升磷酸盐缓冲液含0．25毫克ATEE。

(2)待测酶液：不含胰蛋白酶的胰凝乳蛋白酶液。因为ATEE可作为胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的共同底物。

操作步骤

1．紫外吸收法测定胰凝乳蛋白酶的活力：取石英比色皿(带盖，光程为1cm)，加入2．80毫升ATEE－0．05M，pH7．0磷酸盐缓冲液，再加入0．20毫升酶液(含10微克左右的酶)

以蒸馏水为空白调零，在751型紫外分光光度计上以237nm波长处，测其光密度的变化。每隔半分钟读一次光密度值。共3～5分钟。

若△O．D／分＞0．400，说明酶液太浓，要适当稀释或减量。

2．计算：

根据时间－光密度关系曲线中的直线部分，任选一时间间隔与相应的光密度值变化(△O．D)，计算酶活力。

酶活力单位(ATEE单位)=△O．D．t／t×0．001

式中：△O．Dt：为任选的t时间间隔(分)内光密度值的变化(降低)；

ε：测定的酶蛋白量(微克)；

1000：酶蛋白由μg换算为mg；

0．001：为光密度降低0．001定为1个ATEE活力单位的常数。

〔注〕目前对于胰凝乳蛋白酶的测定，N－苯甲酰－L酪氨酸乙酯(BTEE)属于最有效的底物，因为它能完全抗拒胰蛋白酶的水解，在此方法中，可根据在256nm波长处，光密度的变化来测定BTEE的水解速度。一个活性单位等于在pH为7．8与25℃下，每分钟水解一个微克分子的底物〔G．G．吉尔鲍特等〕。