维生素B12的测定方法

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化学名：Coα-〔α－(5，6－二甲基苯并咪唑基)〕－Coβ氰钴酰胺(Cyanocobalamin)

结构式：

分子式：C₆₃H₈₈CoN₁₄O₁₄P

相对分子质量：1355．38

一、维生素B₁₂的鉴别

(1)取本品约1mg，加硫酸氢钾约50mg，置坩埚中，灼烧至熔融，放冷，加水3mL，煮沸使溶解，加酚酞指示液1滴，滴加氢氧化钠试液至显淡红色后，加醋酸钠0．5g、稀醋酸0．5mL与0．2%1－亚硝基－2－萘酚－3，6－二磺酸钠溶液0．5mL，即显红色或橙红色；加盐酸0．5mL，煮沸1min，颜色不消失。

(2)取含量测定项下的溶液，照分光光度法测定，在波长278nm、361nm与550nm处有最大吸收峰。

吸光度361nm与吸光度278nm的比值应为1．70～1．88。

吸光度361nm与吸光度550nm的比值应为3．15～3．45。

二、维生素B₁₂的含量测定

避光操作。取本品，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1mL中约含25μg的溶液，照分光光度法，在波长361nm处测定吸收度，按C₆₃H₈₈C₀N₁₄O₁₄P的吸收系数()为207计算，即得。

三、食品中维生素B₁₂的测定微生物法

1．原理

使用醋酸盐缓冲液在pH4．5下从食物中抽出维生素B₁₂。游离的不稳定钴氨素，在氰化钠存在下转变为稳定的氰基钴氨素(Cyanocobalamin)。适当稀释之后，在仔细控制的条件下对维生素B₁₂有特定生长需要的荥氏乳酸杆菌(Lactobacillus leichmanii)所产生的浊度来估算维生素B₁₂的含量。

2．试剂和溶液

2．1 醋酸钠缓冲液 溶解2．9mL冰醋酸(相对密度1．05)和6．8g三水合醋酸钠于水中，并稀释至500mL。

2．2 1%氰化钠溶液 溶解1g于100mL蒸馏水中(毒药，特别小心)。

2．3 维生素B₁₂测定培养基 Difco(0457－15)。对6h肉汁管和标准均用单料。为此每100mL水中溶解4．25g培养基。

微量接种体肉汁：Difco(0320－02)，按标签说明制备。

2．4 维生素B₁₂标准贮备溶液 溶解10mg氰基钴氨素于1L25%乙醇－水混合液中。贮存在深色瓶中，冰箱中保存(10μg／mL)至少稳定1个月。

2．5 试验菌 荥氏乳酸杆菌(英国国立工业细菌收藏馆8118号或美国标准菌库7830号)。

3．仪器及设备

测定试管：25mm×150mm和19mm×150mm重型Pyrex玻璃制

水浴：100℃

滤纸：Whatman No．42或No．541，Schleicher and Schiill No．589或No．1505

EEL浊度计

4．测定方法

4．1 萃取 称取0．25～5．0g样品(维生素B₁₂含量不超过40ng)于25×150mm的测定试管中，加20mL醋酸盐缓冲液和2滴氰化钠溶液，用铝箔盖盖好，沉浸在沸水浴中30min，冷却，用水定容至50mL，用Whatman No．42滤纸过滤(不含脂肪的样品用No．541)。必要时滤液冰箱中过夜。

4．2 制备接种体 将菌体从荥氏乳酸杆菌培养基转移到含5mL无菌微量接种体肉汁的试管中，在37℃培养过夜，混匀，无菌地转移一滴到含有5mL用维生素B12强化的单料维生素B12培养基的试管中，于37℃培养6h，用无菌移液管转移一滴到含有10mL单料测定培养基的测定试管中以制备接种体。

4．3 制备测定液 取贮备液(10μg／mL)2mL加氰化钠2mL，用水定容至1000mL，得标准中间液(20ng／mL)。

4．3．1 取标准中间液(20ng／mL)4mL，用水定容至100mL，为标准工作液(0．80ng／mL)。

4．3．2 吸取二份标准工作液：0．0，0．05mL，0．1mL，0．15mL，0．20mL，0．25mL于测定试管中。

4．3．3 必要时，将样品萃取液稀释为0．80ng／mL，吸取0．05mL，0．10mL，0．20mL各二份于测定试管中。

4．3．4 使用适用的分配器，添加10mL单料培养基到每支测定试管，同样加10mL培养基到另外5支测定管中作空白或用于接种体制备中。

4．3．5 盖好所有试管，置121℃杀菌5min，取出，在水浴中冷却到30℃以下。

4．4 试管的接种与培养 在所有测试管中，迅速加1滴接种体，空白除外，于37℃培养22h。

4．5 生长的测定 混匀每组试管的内容物，用未接种的空白管调节EEL浊度计零点，用标准管调读数95%～100%，读侧定管读数。

5．分析结果的表述

以标准维生素B₁₂含量微克数和浊度计读数绘制标准曲线。

从曲线上查得每对测定试管中维生素含量(pg)x₁、x₂、x₃。

设：测定用液体数量(mL)分别为V₁、V₂、V₃。

则样品萃取液中维生素B₁₂的浓度(x₁／V₁+x₂／V₂+x₃／V₃)／3=apg／mL

维生素B₁₂含量(μg／100g)=(a×V×10^－2)／(w×10⁶) (9－64)=a×V／w×104

式中 w——样品质量，g

V——萃取液体积，mL