细胞无性系的选择方法

---

通常，在诱导愈伤组织和继代培养细胞时，仅得到很少量的次生代谢物。然而，最近通过无性系的选择，某些细胞株具有比在整体植物中还高的次生代谢物产量。由于培养细胞中存在异质性，就可能选择次生代谢产物高产量的细胞株。因此，可能用根据某些特性来选择细胞和发展细胞系。例如，光自养生物的细胞，抗性细胞，高维生素产量的细胞，高色素产量的细胞和高生物碱的细胞，这些细胞分别已在各种植物中得到。

有用代谢物高产量的细胞选择，对于利用细胞培养生产有用化合物是一个重要方法。选择特殊的细胞，一般有二个方法：单细胞和细胞团无性系。单细胞的分离和培养存在困难，因而限制了这种方法的应用。可是后来出现了细胞团克隆的方法，虽然化费了很长时间，但到目前为止，它是一种较容易而很成功的方法。

Yamada等(1981，1980)用细胞团无性系的方法已成功地建立了大戟花色素的高产量的细胞株。

无性系的选择有两个值得注意的问题：(1)在选择细胞株时，如何确定次生代谢物高产量是稳定的?(2)这种稳定性有多长时间?

选择细胞无性系的基本步骤见图14-1。大戟最初愈伤组织是从叶片上诱导来的。它能产生红色素、花青素单糖苷。愈伤组织的颜色是红白色相杂的。这些愈伤组织用解剖刀切成128块(细胞团，约3mm)，每一块编上号，放在装有琼脂培养基(25ml)的直径为9cm的培养皿中。琼脂培养基由MS基本溶液，附加1μM2，4-D、0．2%(w／v)麦芽提取液，2%(w／v)蔗糖和0．8%(w／v)琼脂组成。切块培养在28℃、60001x荧光灯下10天。一个培养皿中9个切块，分别被分成2个细胞团；一个(D₁)作为继代培养，另一个(D₂)用来分析色素含量。Yamamoto等通过对D₂的分析，从每一培养皿中选择的最红的D₁细胞团，这些选择得到的细胞团再切成几小团(细胞团，约3mm)。所有这些小团被编上号，并转接到新鲜培养基中，培养基成分同上，这个选择过程重复了28次。

图14-1 选择方法略图

A=起源于大戟愈伤组织被分成128个切块，培养在培养皿中的琼脂培养基，每皿9块分开培养，并记上每块的编号

B=在28℃6000lx下培养10天

C=把生长细胞块一分为二，一个继代培养(D₁)，一个用于分析色素含量(D2)

D₁=D₁中最红的细胞块移至培养皿(E)中。

E=每个红细胞块再分成几块，把最红的块再转移，然后编号和培养在琼脂培养基上．

大戟愈伤组织开始是混杂红色的，经过28次转代培养，可连续地选择出最红的细胞团进行培养。从16至28继代培养中，细胞团色素含量的分布频率的两个特征数(和C^max)进行作图(参见图14-2)。

图14-2 两个特征性极限的趋势

C^max=最大值，=平均值细胞培养条件：MS+2，4-D(1μm)+0．2%麦芽提取液+2%蔗糖；28℃；1000lx光照；每10天继代一次。

色素含量平均值从16代到22代，几乎增加三倍，但低于23代后的平约值(为7．46±0．56)，它比开始时愈伤组织色素含量(1．05)高出7倍，最大值(C^max)从16代到19代也几乎成直线增长，它低于20代后的最大值12．96±2．36。

9A和9F细胞系是取自于第九代的9A和9F细胞团，在这一继代培养中，9A和9F系产生的红色素含量最高。从16代到24代，这二个细胞系中细胞团数目分布频率见图14-3。

在16代，9F细胞系的分布频率低于9A细胞系，这个速率渐升高到24代，达到100%。Yamamoto等发现色素含量平均值()在无性系24代以后达到稳定(见图14-2)。另外，9A细胞系的细胞团数量分布频率在24代后达到100%(见图14-3)。24代后所有的细胞团从9F细胞团得到。如果细胞团中次生代谢物的含量平均值通过连续的克隆选择是稳定的，所有的细胞团是从一个细胞团得来，则构成这些细胞团的细胞，其次生代谢产物是高产而稳定的。这些试验结果表明，从大戟愈伤组织24代无性系选择，有可能分离和得到高产量和稳定的细胞株。

图14-3 9A和9F细胞系的各继代中细胞数目的分布频率

分布频率以每个细胞系的细胞团数目／总细胞团数目×100表示之。

通过上述的实验，确信培养细胞早期是异原性的，存在有不同色素含量的细胞。结果已经表明9F细胞系比9A细胞系有更多的细胞团数日，9F细胞团又有较高色素含量的各种细胞。

在初期实验中，Yamamoto等通过大戟细胞培养，想得到高色素含量的细胞株没有成功，因为单细胞培养是相当困难的。细胞团无性系则优于单细胞无性系。

【参考文献】：

〔1〕Constabel，F．，Gamborg，O．L．，Kurz，W．G．W．，and steck，W．1974 Prodtiction of secondary metaboliteS in plant cell cultures．Planta Med．25∶158-165．

〔2〕Dougall，D．K．1980 Production of biologicals by Plant Cell Culture．In：Advances in Experimental Medicine and Biology(J．C．Petricciana etal．eds．)pp．136-151．Plenum，New York and London．

〔3〕Fujita，Y．，Hara，Y．，Ogino，T．，and suga．C．1981 Production of Shikonin derivatives by Cell Suspension Cultures of Lithospermun erythrorhizon．Plant Cell Rep．1∶59-63．

〔4〕Watanable，K．and Yamada，Y．1982 The selection of Cultured plant cell lines producing high levels of biotin．Phytochemistry 21∶513-516．