紫草宁色素生产

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紫草系多年生植物，紫草根是一味重要的中药，内含有红色素，这些色素具萘环结构，较低的脂肪族环酯和脱氧的紫草宁衍生物(见图14-15)。

图14-15 紫草宁衍生物的结构

在日本，红色素已长期被用来作创伤、烧伤的药物，还是治痔疮的煎物。

Tabata等(1974)通过紫草细胞培养来研究紫草宁衍生物的生产。他们的研究表明，从种子得到的愈伤组织在附加1μM IAA和10μM KIN的LS琼脂培养基上培养，能得到紫草宁衍生物。Miznkami等(1977)也报道了蔗糖、氮元素等的营养物对紫草宁的效应。

据Tabata，Fujita(1981)等用大容器进行细胞悬浮培养，可以生产紫草宁的衍生物。他们的目标在于通过附加一些特殊成分，来改进紫草宁衍生物的生产。细胞株M-18培养在一种已知的液体培养基中；Fujita等(1981)研究了其细胞生长的紫草宁衍生物产生数量。

在一种适合于细胞生长的LS培养基中进行细胞悬浮培养，没有紫草宁衍生物产生，虽然White培养基对于紫草宁衍生物的产生是有利的，但对细胞生长不利。然而Fujita等认为这两种培养基结合使用可能有利于紫草宁衍生物的细胞生产，因为这样可以弥补各自的不足。Fujita等还评价了分二阶段培养的方法。第一阶段用细胞增殖的LS培养基，适合于细胞生长，接着用White培养基，有利于紫草宁衍生物的生产。实验结果见表14-4。虽然培养用二个培养基连续培养达23天，细胞增长达20倍，而第二阶段中细胞产生紫草宁衍生物可达130mg／1，并没有受第一阶段LS培养基的影响，于是Fujita等决定采用二步法生产紫草宁衍生物。

紫草宁衍生物生产的培养基图14-9显示了培养基对细胞生长和紫草宁衍生物生产的极大影响。表14-8中用的LS和White培养基是从表14-9结果中选出来的。因此，对于细胞生长的紫草宁衍生物生产最好的培养基可能是各种培养基的混合物，而不只是上面所提的两种。Fujita等(1981)研究了LS培养基中各种组分水平与细胞生长之间的关系，以及White培养基中各种组分与紫草宁衍生物产量间的相互关系，以决定对次生产物合成的最适培养基。

表14-8 二步法培养对细胞生长和紫草宁衍生物生产的影响

表14-9 培养基类型对细胞生长和紫草宁衍生物产量的影响a

a．0．5g鲜重的细胞接种到100ml三角瓶中，其中装有27ml培养基，25℃黑暗中培养14天，所有培养基中都加1μMIAA和10μMKIN。

结果提出White培养基中最独特的化合物对紫草宁衍生物生产有强烈的效果，同样对细胞生长也有效。无机物和有机物对紫草宁衍生物产量的效应如下：

无机化合物。White培养基含有15种无机物，其中，Cu⁺²和SO₄^-2对紫草宁衍生物产生有最强的效应。当浓度逐步增加但低于10mM时，紫草宁衍生物产量的细胞生长都增长(图14-16)。对细胞生长和衍生物生产最适浓度是6．7mM，这与White培养基中的浓度(3．3mM)是不同的。Cu⁺⁺的增加伴随着紫草宁衍生物产量的增加，但是超过0．8μM以后则为恒定。基于这些结果，Fujita等采用了1．2μMCu⁺⁺，相当于White培养基中Cu⁺⁺浓度的30倍。Cu⁺⁺浓度对细胞生长几乎无影响。紫草宁衍生物产量随着浓度增加而逐渐上升，最适浓度为13．5mM(White中为4．5mM)，对细胞生长也有轻微抑制作用。

图14-16 NO^-₃浓度对紫草宁衍生物和细胞生长的影响White培养基的NO₃^-是3．3mM

有机化合物。蔗糖浓度逐渐增加到2%。紫草宁衍生物产量也随之增加，但超过5%就有抑制作用。细胞生长也随着蔗糖浓度增加而增强，但超过4%则起阻抑生产作用。Fujita等将其浓度固定在3%。

对紫草宁衍生物生产最适的培养基是通过对White培养基各种组分最适浓度重新组合而得到。这被Fujita等称为M-90培养基。它的组成与White的比较(表14-10)。M-9明显特征是Cu++浓度相当高。无机物种数减少并加入维生素或氨基酸。

表14-10 White和M-9培养基组分

Fujita等的MG-5培养基(表14-11)，是细胞生长的最适培养基。而对紫草宁衍生物生产最适的培养基是M-9，细胞的二步法培养应用这两种新的培养基，结果见表14-12。

表14-11 LS和MG-5培养基组成

表14-12 用MG-5和M-9培养基两步培养的结果

这样，通过二步培养，紫草宁衍生物产量多达1500mg／l(含量达13．6%)，其产量是用LS和white的11．5倍。另外，生长速率提高到1．1倍。每个接种物的紫草宁衍生物产量由此增加1．3倍，这是一个明显的提高。

利用紫草细胞悬浮培养物进行紫草宁衍生物的高产量的生产。很明显，适合于细胞生长和产量的理想培养基是不同的。为了得到较高产量的紫草宁衍生物，采用二步法培养。第一步培养促进细胞生长，而第二步则促进紫草宁衍生物的产生。随着培养基的发展，找到最适的二步法培养基，可产生1500mg／l紫草宁衍生物，大约比以前高出13倍。植物自然生长得到紫草要2-3年才收获一次。而利用组织培养只要约3周。因此大大缩短了生产周期，细胞培养中紫草宁衍生物含量约14%，大大高于一般田里紫草含量(1-2%)。通过细胞培养紫草宁衍生物的化学合成与紫草植株中的很相似，结构上仅有很小变动。

【参考文献】：

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〔2〕Dougall，D．K．1980 Production of biologicals by Plant Cell Culture．In：Advances in Experimental Medicine and Biology(J．C．Petricciana etal．eds．)pp．136-151．Plenum，New York and London．

〔3〕Fujita，Y．，Hara，Y．，Ogino，T．，and suga．C．1981 Production of Shikonin derivatives by Cell Suspension Cultures of Lithospermun erythrorhizon．Plant Cell Rep．1∶59-63．

〔4〕Watanable，K．and Yamada，Y．1982 The selection of Cultured plant cell lines producing high levels of biotin．Phytochemistry 21∶513-516．