步骤

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(1)将电泳后的凝胶、硝酸纤维滤膜、海绵滤纸浸入印迹缓冲液中各30分钟。

(2)将有孔转移框架展开于搪瓷盘中，覆上一块用转移缓冲液湿润的海绵垫，然后依次覆上滤纸、凝胶，小心将硝酸纤维素膜铺在凝胶面上，依次铺上滤纸、海绵垫，合上有孔转移框架形成一个“夹心饼”(图3－2)，图3－2立即插入转移电泳装置内，凝胶一面接负极，硝酸纤维素膜的一面接正极。

图3－2 免疫印迹技术夹心饼示意图

1．有机玻璃网孔板；2．海绵；3．滤纸；4．硝酸纤维素膜；5．凝胶

(3)将转移电泳槽接上冷却水，开动循环泵调节电压，使电场强度约4～8v／cm，一般转移3小时。

(4)转移结束后，关闭转移电源，取出有孔转移框架，用镊子拿出印迹后的硝酸纤维素膜，用0．01%氨基黑(AmidoBlack)染色检查转移情况。

(5)将膜在培养皿中侵入PBS-T溶液洗涤4次，每次15分钟。洗涤时放入恒温(40℃)摇床振摇，注意结合有蛋白质膜面朝上。

(6)倾去PBS-T洗涤液，加入抗血清(用PBS-T稀释至1∶500)，将膜浸泡，在37℃振摇1小时。

(7)倾去抗血清溶液，将膜用PBS-T洗涤液在室温下侵洗3次，每次10分钟。

(8)倾去PBS-T洗涤液，加入抗体即第二配体溶液(将辣根过氧化物酶联羊抗兔IgG抗体稀释至1∶1000)，37℃振摇1小时。

(9)倾去第二配体溶液，将膜用PBS-T洗涤液室温浸洗3次，每次10分钟。

(10)倾去PBS-T洗涤液，加入底物溶液，37℃或室温振荡保温5～10分钟，待布条清晰后，用自来水冲洗掉底物溶液，中止反应。

(11)分析显色条带分子量，可与染色结果对照分析。