常用染色法及染色液的配制

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一、革兰(Gram)氏染色法

(一)染色法

1．涂片、自然干燥、火焰固定；

2．滴加草酸铵结晶紫液染1～3min；

3．水洗后滴加碘溶液1～3min；

4．水洗后滴加95%酒精脱色约20～30s(直到不脱色为止)；

5．水洗后以石碳酸复红液或沙黄液复染1／2～1min；

6．水洗后吸干、镜检。

(二)结果 革兰氏阳性菌为紫色，革兰氏阴性菌为红色。

(三)染色液

1．草酸铵结晶紫(或龙胆紫)溶液。结晶紫原液20ml(结晶紫10g溶于100ml95%酒精中)与10%草酸铵水溶液80ml混合即成；

2．碘溶液。称取碘化钾2g溶于20ml蒸馏水中，待完全溶解后，再加碘片1g，溶解后再加蒸馏水280m1，使全量为300m¹即可；

3．95%酒精或丙酮酒精溶液(95%酒精70ml，丙酮30ml)；

4．石炭酸复红溶液。称取碱性复红4g放乳钵内研细，徐徐加入95%酒精100ml使成饱和液，再取饱和液10ml与5%石碳酸溶液90ml混合即成。

二、瑞特(Wnight)氏染色法

(一)染色法

1．涂片、自然干燥；

2．滴加瑞特氏染液染1min，使标本被其中甲醇所固定；

3．加等量pH6．4的磷酸盐缓冲液(若无磷酸盐缓冲液用蒸馏水代替亦可)轻轻晃动玻片，混匀静置5min；

4．水洗、吸干、镜检。此法适于染色血片及组织片。

(二)染色液 称瑞特氏染料0．1g放玛瑙或玻璃乳钵内加纯甘油1ml研细，再加入中性甲醇60ml，溶解后装棕色瓶中，放暗处经一周过滤，保存备用。

(三)原理 瑞特氏染料是碱性美蓝与酸性伊红钠盐混合而成的染料，当溶于甲醇后即发生解离，分解成酸性和碱性两种染料，染色时，细胞中的嗜酸性物质即与碱性美蓝结合而染成蓝色；而嗜中性物质则同时吸附酸碱两种染料而成紫红色。

三、姬姆萨(Giemsa)氏染色法

(一)染色法

1．涂片、自然干燥；

2．滴加甲醇2～3滴固定2～3min；

3．将固定片浸于盛姬姆萨染色液缸中染30min以上或过夜；

4．水洗、干燥、镜检。

(二)染色液 称取姬姆萨染料粉末0．5g溶于纯甘油33ml中，水浴加温55°～60℃，1～2h使充分溶解，再加入33m1甲醇混匀，静置一日以上，滤过后置有色瓶中，临用时取上述配液1m1加蒸馏水10ml即可。

(三)原理 与瑞特氏染色法基本相同。

四、碱性复红染色法

(一)染色法

1．涂片、干燥、固定；

2．滴加碱性复红染色液染1～3min，水洗、吸干、镜检．

(二)结果 菌体呈红色。

(三)染色液 取碱性复红1g溶解于100ml95%酒精中，静置24h，过滤并加水900ml即成．

五、碱性美蓝染色法

(一)染色法

1．涂片、干燥、固定；

2．滴加适当美蓝染液染色1～3min；

3．水洗、干燥、镜检。

(二)结果 菌体呈蓝色，久存的美蓝具有多色性，能将菌体染成蓝色，荚膜染成红色，此法为最简单的荚膜染色法。

(三)染色液 美蓝酒精饱和溶液(95%酒精100ml，美蓝2g)30ml，10%氢氧化钾溶液0．1ml，蒸馏水100ml混合摇匀，滤纸过滤后备用。在美蓝染液中加入氢氧化钾其作用是中和美蓝染料内所含的酸性物质，使染色效果更佳。此液可长期保存。

六、荚膜染色法

1．美蓝染色法 抹片自然干燥，甲醇固定，以久储的多色性美蓝液作简单染色，荚膜呈淡红色，菌体呈蓝色。

2．瑞特氏与姬姆萨染色法抹片自然干燥，以瑞特氏或姬姆萨氏染色液染色，荚膜呈淡紫红色，菌体呈蓝色。

3．奥尔特(O1t)氏荚膜染色法

(1)染色法

①涂片，自然干燥，加热固定；

②滴加沙黄染色液，并加热至产生蒸气后，继续染3min；

③水洗、干燥、镜检。

(2)结果 菌体呈赤褐色，荚膜呈黄色。

(3)染色液 称取沙黄3g，放乳钵研磨徐徐加水100ml溶解即成。

七、芽孢染色法

用复红美蓝芽孢染色法。

(1)染色法

①涂片、干燥、固定；

②滴加石碳酸复红溶液并加热使蒸气出现5min，冷却后水洗；

③用95%酒精脱色2min，水洗；

④滴加碱性美蓝液复染1min，水洗、干燥、镜检。

(2)结果 菌体呈蓝色，芽孢呈红色。

(3)染色液

①石碳酸复红液：即碱性复红酒精饱和液10ml，5%石碳酸液90ml混合即成；

②95%酒精；

③碱性美蓝液(配制见碱性美蓝染色法)。

(4)原理 细菌的芽孢外面有较厚的芽孢膜，能防止一般染料的渗入，如用碱性复红，美蓝等作简单染色，芽孢是不易着色的，采用对芽孢膜有强力作用的化学媒染剂如石碳酸复红进行加温染色，芽孢着色牢固，一但芽孢着色后，于酸类溶液处理也难使之脱色，因此再用碱性美蓝溶液复染，只能使菌体着色。

八、鞭毛染色法

1．莱佛逊(Leifson)氏鞭毛染色法

(1)染色法 先将细菌每日在肉汤培养基中移种一次，共3～5次。取出琼脂斜面培养基内的凝结水，换无菌生理盐水2ml，接种一接种环菌液至琼脂斜面与液体交界部分，再自该部向上划线。37℃培养7～16h，以接种环自该交接处取出一环菌液，轻轻放在盛有3～4ml蒸馏水的小碟表面，让细菌自由分散，浮在液体表面，静置2min。用接种环由上述液面轻轻挑取一环菌液，放在高度洁净无油脂玻片的一端，玻片成倾斜度，使菌液沿坡度下流而成一薄膜层。置37℃温箱内让其自干，不能火焰固定。滴加染液在温暖处染色4～8min，水洗、自然干燥、镜检。

(2)结果 鞭毛呈红色，菌体亦成红色。

(3)染色液 钾明矾饱和水溶液20m1，20%鞣酸水溶液10m1，蒸馏水10m1，95%酒精15ml，碱性复红饱和酒精液3ml，按上列次序将各液混合，置紧塞玻瓶中，保存期为一周。

(4)注意事项

①玻片要求严格洁净、无油脂、无划痕。

②染色时注意室内温度，天气冷应加温。

(5)原理 鞭毛宽一般约0．01～0．05μm，在普通光学显微镜下看不见，用特殊染色法在染料中加入明矾与鞣酸作媒染剂，让染料沉着于鞭毛上，使鞭毛增粗，容易观察，染色时间愈长，鞭毛愈粗。

2．凯氏(Kirkpatrick’s)染色法

(1)染色法

①标本制作同莱佛逊氏法；

②用固定液处理1～3min，使酒精洗后再用水充分洗净；

③用媒染剂处理3～5min，水洗；

④加过滤银染色液，并缓缓加热至涂片成深褐色，而液体边缘有金属光泽为止，约15s，静置使溶液再作用15～30s，水洗、干燥、镜检。

(2)结果 鞭毛为淡褐色或灰色，细菌呈黑色。

(3)染色液

①固定液：无水酒精60ml，氯仿30ml，福尔马林10ml混合即成；

②媒染剂：5%氯化高铁水溶液1份，20%鞣酸水溶液(加热溶解并冷却)3份混合，用前以蒸馏水稀释1倍；

③银溶液：

银贮备溶液：称硫酸银l0g加蒸馏水200ml，在37℃培养箱中放24h，此溶液可长久保存备用。

银染色液：取40ml滤过的银贮备溶液加33%乙胺0．6ml(此时析出的沉淀又即溶解)最后再加蒸馏水10ml即用。

九、异染颗粒染色法

1．美蓝染色法(用五、碱性美蓝染色法的染色液)

(1)染色法

①涂片、干燥、固定；

②滴加多色性美蓝液染色30～60s，水洗、干燥、镜检。

(2)结果 异染颗粒呈淡红色，菌体为深蓝色。

2．奈瑟氏(Neisser)染色法

(1)染色法

①涂片经加热固定，甲染液染30～60s，水洗；

②滴加乙染液染30s，水洗、干后镜检。

(2)结果 异染颗粒呈深紫色，菌体为黄褐色。

(3)染色液

①甲染液：称美蓝0．1g溶于酒精(95%)2ml中后，加冰醋酸5ml及蒸馏水95m1，混合过滤。

②乙染液：俾斯麦褐(亦名俾斯麦棕)0．2g溶于100℃蒸馏水100m1中，过滤待用。

(4)原理 异染颗粒的主要成分为核糖核酸和多偏磷酸盐，嗜碱性强，故用特殊染色法可染成与细菌其他部分不同的颜色。

十、抗酸染色法

1．萋-尼(Ziehl-Neelsen)二氏抗酸染色法

(1)染色法

①涂片、干燥、固定；

②滴加石碳酸复红液微温至现蒸气并保持，染色5min(不可煮沸，染色液蒸发减少时，应随时添加，冷却后水冲洗)；

③3%盐酸酒精脱色30～60s，水洗；

④0．5%美蓝液复染1min，水洗、干燥、镜检。

(2)结果 抗酸菌呈红色，其他菌或细胞呈蓝色。

(3)染色液

①称碱性复红5g，结晶石碳酸25g，溶于95%酒精50ml中，于温水浴中进行溶解，然后加蒸馏水500ml，使用前过滤。

②95%酒精97ml，浓盐酸3ml。

③0．5%美蓝水溶液。

(4)原理 抗酸性细菌含类脂质较多，普通染色不易着染，如加温或延长染色时间使之着色后，即使以盐酸酒精脱色也不易脱掉。

2．Pooman氏染色法

(1)染色法

①涂片、干燥、固定；

②滴加石碳酸复红液染色1min，水洗、干燥；

③用1%美蓝酒精液复染20s，水洗、干燥、镜检。

(2)结果 与萋-尼二氏染色法判定方法相同。

十一、布氏杆菌鉴别染色法

(1)染色法

①涂片、干燥、固定；

②滴加0．5%沙黄液微温染色2～3min，冷却、水洗；

③滴加0．5%孔雀绿水溶液复染1～2min，水洗、干燥、镜检。

(2)结果 布氏杆菌呈红色，其他细菌或细胞呈绿色。

十二、螺旋体染色法

1．镀银染色法

(1)染色法

①涂片、干燥、滴加固定液1～2min，水洗，

②将片子放于60℃水浴锅的架上，加染色液染5min，弃去；

③加显影液待出现深黄色，水洗、干燥、镜检。

(2)结果 背景为黄色或棕色，螺旋体为黑色或褐灰色。

(3)染色液

①吐温80储存液：吐温80，10ml，95%酒精100ml混合即成；

②固定液。吐温80储存液2ml；甲酸(80～100%)5ml，95%酒精10ml；

③染色液：硝酸银5g，蒸馏水100ml；

④显影液：对苯二酚200g，吡啶2。5g，松香饱和液1ml，无水亚硫酸钠50g，蒸馏水90ml。

(4)注意事项 松香与水混合后；每日摇动2～3次，经4～5日上清液透明，有少量松香析出即可应用。

对苯二酚，吡啶分别溶解、混合，呈乳状液，装有色瓶中，外包黑纸备用。

(5)原理 硝酸银与酒精作用后生成白色氢氧化银沉淀，而氢氧化银与菌体中嘌呤在还原剂的作用下成为嘌呤银盐，此银盐为黄褐色，同时银盐的堆集使菌体变粗。

2．刚果红染色法

(1)染色法

①在洁净的载玻片上，滴加螺旋体标本和2%刚果红水溶液各一滴，混合，涂成薄膜；

②自然干燥，在涂片上加几滴1～2%盐酸酒精，刚果红则由红变蓝，干燥后不必用水冲洗。

(2)结果 镜检可在蓝色背景下见有透明未染色的螺旋体。

十三、真菌染色法

1．过碘酸锡夫氏染色法

(1)染色法

①制片、干燥；

②加甲液染10min，水洗；

③加乙液染2～3min，倾去；

④加丙液染30～40min，至玻片呈淡粉红色，水洗；

⑤加丁液染3min，充分水洗。

(2)结果 真菌组织染为鲜红色。

(3)染色液

①甲液：1%过碘酸水溶液。

②乙液：碱性复红0．1g，95%酒精5ml，蒸馏水95m1。

③丙液：连二亚硫酸锌(Zinc hydrosulfite，ZnO₂S₄)1g，酒石酸0．5g，蒸馏水100ml。

④丁液：饱和苦味酸液(苦味酸1．22g，水100m1)。

2．乳酸酚棉蓝染色法

(1)染色法

①取洁净载玻片中央加染色液两滴；

②用接种针挑取培养物检样放于染色液中，

③左右手各持一接种针将检样布匀，覆盖盖玻片，微加温后镜检。

(2)结果 真菌为蓝色。

(3)染色液 纯石碳酸20g，乳酸20ml，甘油40ml，蒸馏水20ml，混合，加温溶解，再加棉蓝0．05g，摇匀即成。

十四、韦森氏(Wayson)氏两极染色法

先将0．3g碱性复红溶于8ml纯酒精中，另将0．75g甲烯蓝(即美蓝)溶于12ml纯酒精中，待完全溶解后，将两者混和，加入5%石炭酸水溶液达200ml，混匀，煮沸，静置48h以上，经滤纸过滤，盛于有色玻瓶，保存于暗处备用。此液保存长到1～2年以后，染色效果佳。

此法用于染示两极性细菌，特别是鼠疫杆菌。将组织染片(培养物不易现两极染色)加热或经酒精固定，以此染液染2～6s，水洗，干燥，镜检。可见鼠疫杆菌两端染色蓝色，菌体中央呈淡蓝色或红色，形态似别针。