大肠菌群的测定

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大肠菌群可作为食品被粪便污染或有病原菌存在的指示菌。大肠菌群数以100mL(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)来表示。

(一)器材

显微镜，温度计，载玻片，其它同菌落计数测定。

(二)培养基及试剂

(1)乳糖胆盐发酵管。

(2)乳糖发酵管。

(3)伊红美蓝琼脂(EMB)。

(4)蛋白胨水。

(5)靛基质试剂。

(6)革兰氏染色液。

(三)方法

1．检验程序

大肠菌群检验程序如图5－2－2所示。

图5－2－2 大肠菌群检验程序

2．检样稀释

(1)、(2)、(3)与菌落总数测定相同。

(4)根据对检样污染情况的估计，选择三个稀释度，每个稀释度接种3管乳糖胆盐发酵管。

3．乳糖发酵试验

接种前将所用乳糖胆盐发酵管编好标记。方法和准则与菌落总数测定相同。然后将上述稀释的并选择好的待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内。接种量在1mL以上者，用双料乳糖胆盐发酵管；1mL及1mL以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管，置(36±1)℃温箱内，培养(24±2)h。如所有乳糖发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产气者，则按下列程序进行。

4．分离培养

编好标记，将上述所有产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置(36±1)℃温箱内培养18～24h，然后取出，观察菌落形态，并作革兰氏染色和证实试验。

5．证实试验

在上述平板上挑取可疑大肠菌群菌落1～2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置于(36±1)℃温箱内，培养(24±2)h，观察产气情况。凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。

6．报告

根据证实为大肠菌群阳性的管数，查表5－2－5MPN检索表，报告每100mL(g)检样中大肠菌群的最可能数。例如所用稀释度为10⁰，10^－1，10^－2，接种量为1mL(g)，最后证实为大肠菌群的阳性管数：10⁰稀释者为3，10^－1稀释者为1，10^－2稀释者为0，则其有效数为310，经查表得出每100mL(g)检样中大肠菌群的最可能数为430。

表5－2－5 大肠菌群最可能数(MPN)检索表

注：①本表采用3个稀释度［1mL(g)、0．1mL(g)和0．01mL(g)］，每稀释度3管。

②表内所列检样量如改用10mL(g)、1mL(g)和0．1mL(g)时，表内数字应相应降低10倍；如改用0．1mL(g)、0．01mL(g)和0．001mL(g)时，则表内数字应增加10倍。其余类推。

(四)判定标准

表5－2－6 肉及肉制品的细菌学指标

附：培养基制造

1．营养琼脂

成分：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂15～20g，蒸馏水1000mL。

制法：将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水中，加入15%氢氧化钠溶液约2mL，校正pH至7．2～7．4。加入琼脂，加热煮沸，使琼脂溶化。分装烧瓶，121℃高压灭菌15min。

注：此培养基可供一般细菌培养之用，可倾注平板或制成斜面。如用于菌落计数，琼脂量为1．5%；如作成平板或斜面，则应为2%。

2．乳糖胆盐发酵管

成分：蛋白胨20g，猪胆盐(或牛、羊胆盐)5g，乳糖10g，0．04%溴甲酚紫水溶液25mL，蒸馏水1000mL，pH7．4。

制法：将蛋白胨、胆盐及乳糖溶于水中，校正pH，加入指示剂，分装每管10mL，并放入一个小导管，115℃高压灭菌15min。

注：双料乳糖胆盐发酵管除蒸馏水外，其它成分加倍。

3乳糖发酵管

成分：蛋白胨20g，乳糖10g，0．04%溴甲酚紫水溶液25mL，蒸馏水1000mL，pH7．4。

制法：将蛋白胨及乳糖溶于水中，校正pH，加入指示剂，按检验要求分装30mL、10mL或3mL，并放入一个小导管，115℃高压灭菌15min。

注：(1)双料乳糖发酵管除蒸馏水外，其它成分加倍。

(2)30mL和10mL乳糖发酵管专供酱油及酱类检验用，3mL乳糖发酵管供大肠菌群证实试验用。

4．伊红美蓝琼脂(EMB)

成分：蛋白胨10g，乳糖10g，磷酸氢二钾2g，琼脂17g，2%伊红溶液20mL，0．65%美蓝溶液10mL，蒸馏水1000mL，pH7．1。

制法：将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶解于蒸馏水中，校正pH，分装于烧瓶内，121℃高压灭菌15min，备用。临用时加入乳糖并加热溶化琼脂，冷至50～55℃，加入伊红和美蓝溶液，摇匀，倾注平板。

5．蛋白胨水(靛基质试验用)

成分：蛋白胨(或胰蛋白胨)20g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，pH7．4。

制法：按上述成分配制，分装小试管，121℃高压灭菌15min。

6靛基质试剂

(1)柯凡克试剂：将5g对二甲氨基苯甲醛溶解于75mL戊醇中。然后缓慢加入浓盐酸25mL。

(2)欧－波试剂：将1g对二甲氨基苯甲醛溶解于95mL95%的酒精内。然后缓慢加入浓盐酸20mL。

靛基质试验方法：挑取少量培养物接种，在(36±1)℃培养1～2d，必要时可培养4～5d。加入柯凡克试剂约0．5mL，轻摇试管，阳性者于试剂层呈深红色；或加入欧－波试剂约0．5mL，沿管壁流下，覆盖于培养液表面，阳性者于液面接触处呈玫瑰红色。

注：蛋白胨中应含有丰富的色氮酸。每批蛋白胨买来后，应先用已知菌种鉴定后方可使用。