培养基的基本原理及制备原则

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培养基是根据各类微生物生长繁殖需要，将各种营养成份按适当比例配制而成，它提供这些微生物生长的条件和环境(如营养物、pH、渗透压、O₂、抑制另一些微生物生长等)，用于微生物的分离、繁殖、鉴别、研究。

一、培养基的基本成分

(一)水 配制培养基所用的水，有的必须是蒸馏水、双蒸馏水或无离子水。如制备生化试验用的许多培养基、加水来制备去水培养基都得用蒸馏水或无离子水，至于制备牛肉浸液等，冷开水或自来水亦可。总之，根据要求而定。

(二)蛋白胨 蛋白胨是蛋白质经蛋白酶(常用胰蛋白酶或胃蛋白酶)酸或碱水解后的中间产物。在水解过程中，蛋白质分解为较小分子的产物，如蛋白、胨、肽甚至氨基酸。上述成分的比例依蛋白胨牌号而不同，所以其营养价值也不尽相同，有的适于某种细菌生长，有的则适于某种生化反应的出现。蛋白胨主要为细菌生长提供氮源。因为它是两性化合物，所以也具有缓冲作用。

(三)肉漫液或牛肉膏 肉浸液即牛肉水浸液，牛肉膏系牛肉浸液经煮沸或蒸沸后浓缩而成。肉浸液中含有两大类物质：一为含氮物质，其中包括肌酸、黄嘌呤、次黄嘌呤、腺嘌呤、尿酸、谷氨酰氨、肌肽和肉毒碱等。另一类为不含氮物质有葡萄糖、磷酸乙醣、乳酸、琥珀酸、脂肪、肌醇和无机盐。除此，尚含有8种维生素B族物质，为细菌的生长因子。牛肉膏营养次于新鲜制备的牛肉浸液。

(四)无机盐类 细菌生长需要一定的盐类。一般培养基中加入钠、钾、镁、硫酸盐、磷酸盐、碳酸盐或醋酸盐等，这些盐类物质兼有缓冲作用并与培养基的渗透压有关。

(五)酵母膏 由酵母细胞提取而得，本身除具营养成分外，还是B族维生素的丰富来源。

(六)琼脂 是从海藻提取的胶聚物质，是一种复合多糖，一般不被细菌利用，只作为培养基的固形剂。琼脂在95℃左右溶解，42℃左右凝固。

(七)碳水化合物 在培养基中加入糖、醇等碳水化合物，供给细菌生长所需的能源和碳源。亦可利用其发酵产物来帮助鉴别细菌种类。

(八)血液及体液 血液、血清或腹水中含有丰富的蛋白质和生长因素，用于培养营养要求较高的细菌。培养基中加入血液，还可测定细菌的溶血作用。

(九)抑菌剂 培养基中加入抑菌剂，抑制某些细菌生长，便于分离和鉴别另一些细菌。

(十)指示剂 生化反应培养基中加入指示剂，观察细菌对各种物质的利用和分解以及pH值的变化情况。

二、制备培养基的要求及注意事项

1．配制培养基所用化学药品均应为化学纯或分析纯或试剂级，称量要准。

2．所用器材应清洁，一般用玻璃(中性硬质)，搪瓷或不锈钢容器；不宜用铜、铝或铁的容器，以免金属离子进入培养基而影响细菌生长。

3．培养基pH值应准确，一般培养基pH值为7．4～7．6，因高压灭菌后pH值约降低0．1～0．2，因此在调pH值时应比实际需要高0．1～0．2。

4．培养基加热次数不宜过多，时间不宜过长，否则营养成分被破坏。

5．制备好的培养基通常要求澄清透明，便于观察细菌生长性状。

6．培养基分装不得超过容器的2／3，以免灭菌时溢出。

7．根据培养基成分，采用适当的灭菌温度、时间和方法。

8．制备好的培养基应作无菌检验，必要时用已知菌鉴定其质量。

9．去水培养基应保存于阴暗干燥处，使培养基始终呈干粉状态。制备的培养基通常应存放于4℃冰箱中，或少量制备一次使用。

三、培养基pH值测定

(一)指示剂的配制

1．常用指示剂感应范围及使用浓度见表1-1。

表1-1 常用指示剂

* 为不加NaOH，用95%酒精配成所需浓度即成。

2．配法。

(1)称取指示剂于玛瑙乳钵内研磨。

(2)按上表加入0．1mol／LNaOH溶液研磨至溶解。

(3)按上表加蒸馏水至规定量即成。配制液应清朗无沉淀。

(二)pH值测定

1．取与标准比色管大小、厚薄一致的小试管三支，各加待测培养基5ml，一支加指示剂0．25ml作测定，另两支不加指示剂作对照。

2．将两对照管连同pH标准比色管(有商品)放入比色盒中。

3．往测定管中徐徐滴加0．1mol／L的NaOH(或0．1mol／L的HCl)溶液，边滴边摇匀，同时与标准比色管比较，至颜色相同为止。记录所用0．1mol／LNaOH(或0．1mol／LHCl)溶液的量。

4．按下例公式计算出全部培养基所需1mol／LNaOH(或1mol／LHCl)溶液的量。

说明：用5除，是测定用了5m1培养基；用10除，是用的是0．1mol／LNaOH(或0．1mol／LHCl)。

附：培养基pH测定常用酸度计，酸度计型号较多，其测定方法按各型号仪器使用说明书实施。

四、培养基的过滤或澄清法

(一)棉花过滤法

1．将漏斗置固定架上。

2．用脱脂棉一块分揭为二，纵横相迭，轻轻压入漏斗。注意厚薄均匀，边缘整齐。

3．用蒸馏水沾湿棉花边缘，使棉花紧贴漏斗，然后徐徐倒入培养基过滤。注意不要冲破棉花。

(二)滤纸过滤法 将滤纸折成三角形，放入漏斗中，用蒸馏水浸湿滤纸，然后徐徐倒入培养基过滤。

(三)鸡蛋白沉淀法

1．每1000ml培养基用1个鸡蛋白。鸡蛋白取法是将鸡蛋壳表面消毒后，大小头各开一小孔并破蛋壳膜，让鸡蛋白从小头孔流出，蛋黄仍留在蛋壳内。每个鸡蛋白加水20ml，搅拌至出现大量泡沫为止。

2．将制备的鸡蛋白液倒入欲清朗的温度低于55℃的培养基(如肉浸液)中，搅匀，煮沸10～15min，使不溶性物质附于凝固蛋白上而沉淀。再用棉花或滤纸过滤。

(四)固体培养基沉淀法

1．将固体培养基盛入广口搪瓷容器内。

2．高压121℃15min，静置于高压锅内过夜。

3．次日取出，用刀切除底层沉渣部分，再溶化、分装、灭菌，即得透明的琼脂培养基。