酶的放射化学测定法
酶活性的测定一般是把底物和有关辅助因子在最适酸碱度和温度下与酶共同保温，经一定时间后停止反应，用物理或化学方法测定产物的生成量（或底物的剩余量），从而求出被测酶的活性(在标准条件下每分钟使底物转变1微克分子所需的酶量叫做酶活性的一个国际单位)。如果使用已知比放射性的标记物为底物，在酶反应停止后，用适当的分离技术将产物与剩余的放射性底物分开，测量产物的放射性活度（或剩余底物的放射性活度），从而计算出样品中酶的活性单位，则称为酶的放射化学测定法。
标记底物 使用标记底物是酶放射化学测定法的主要特点，也是这种方法所以具有高灵敏度和高特异性的原因。对标记底物的化学纯度和放射化学纯度的要求较高。标记物因辐射自分解或其他原因而产生的放射性杂质，往往增高空白计数，使方法的灵敏度降低。所以在保存高比放射性标记物时最好加入载体（本方法不要求标记物比放射性太高），并且要定时或在使用前进行纯化。在使用氚标记物时还应注意：
❶有时由于标记位置不稳定，在反应或分离过程中可有放射性丢失，以致影响测量结果；
❷当酶反应需要定位标记物时，要注意标记位置的准确性；
❸在酶促羟化反应中，被羟基取代的3H有时并不释放到反应液中生成THO，而可能迁移到分子内的其他位置上，从而引出错误的结果。这种情形叫做羟化诱发的分子内迁移(hydroxylation-induced intra-molecular migration)。
标记底物的比放射性要求准确，因为这是精确计算酶活性单位的依据。至于所用标记底物的比放射性以多大为宜，一般说这是由底物浓度、反应液体积、底物转变百分率、核素种类和测量仪器效率等多种因素决定的。使用高比放射性标记底物不但易于发生辐射自分解，且造成不必要的浪费。仅仅当被测酶的米氏常数小、样品量太少和底物转变率过低时，才使用较高比放射性的标记底物，以便得到较高的灵敏度。
标记产物和剩余底物的分离方法 放射性产物和剩余底物的分离方法是多种多样的。选择那一种分离方法要根据每种酶的放射化学测定法的要求和实验室条件而定。各种层析法，各种电泳法，沉淀法以及溶剂抽提法等方法最常用，也为人所熟知。下面仅简述几种较特殊的方法：
(1) 挥发性产物的分离法： 最常遇到的挥发性产物是在羟化酶作用下生成的THO以及在脱羧酶作用下产生的14CO2。通常可用蒸馏法、离子交换法或吸收法收集THO，用液体闪烁法测量放射性活度。14CO2则可直接被引入电离室或流气式计数管，也可被吸收于浸有碱液的纸片上或含有碱液的闪烁液中而后测量放射性。其他酶反应的易挥发性产物如14C-乙酸等，多用蒸馏法分离。
(2) 偶联酶反应： 在被测酶的反应系统中偶联另一个酶反应，目的在于使标记底物与产物易于分离和扩大放射化学测定法应用的范围。例如在测定UDP-半乳糖-4-表异构酶的活性时，产物UDP-[14C]葡萄糖，不易与剩余底物UDP-[14C]半乳糖分开。若加入一个UDP-葡萄糖脱氢酶使UDP-葡萄糖氧化成UDP-葡萄糖醛酸，就易于分离了。
当标记底物不稳定，价格昂贵或不易合成时，可于被测酶反应液中加入另一种酶，以“就地”合成所需的标记底物。如欲测定各种乙酰基转移酶时，可于被测酶的反应液中加入乙酰-CoA合成酶和[14C]-乙酸，以“就地”合成乙酰基转移酶所需要的底物[14C]-乙酰CoA。
有时被测酶的反应产物不稳定，可改用非标记底物，并利用另一种酶和某种标记试剂使被测酶反应的不稳定非标记产物成为稳定的次级标记产物。例如测量多巴胺β-羟化酶的活性时，以非标记酪胺为底物，其产物对羟苯β-羟胺不稳定； 若另加入苯乙醇胺转甲基酶和[14C-甲基]S-腺苷蛋氨酸，则对羟苯β-羟胺变成稳定的次级产物[14C-甲基]脱氧肾上腺素，分离后测量次级产物的放射性。
(3)核素反稀释法： 在酶反应停止后，加入大量非标记产物并分离、提纯产物。取一部分稀释产物测比放射性，再乘以非标记产物的加入量便得到产物的总放射性，从而计算出酶活性单位。此法麻烦，不够灵敏，用者不多；但可除去某些放射性杂质的干扰。
(4) 固相底物法： 联结在琼脂糖上的标记产物，在酶的作用下，产物释放到反应液中，经离心或过滤后，取上清液测量产物的放射性。此法多用于蛋白质水解酶类。酶的放射化学测定法的优点 有以下几点。
(1)灵敏度高： 酶的放射化学测定法的灵敏度比其他常用的酶活性测定法一般高几十倍、百倍，甚至千倍。多数情况下，底物的转变量可测至10-12克分子水平。因此这种方法有利于测定组织中极微量的酶活力。由于灵敏度非常高，扩大了底物浓度的可变范围，适于做米氏常数的测定。此外还可在底物浓度很低的情况下研究竞争性抑制作用； 可以在高度稀释的样品中测得酶活力而不受或少受组织中竞争性抑制剂的影响。
(2) 特异性强： 一般说来，常用的酶活力测定法往往因内源性产物或药物的干扰而影响测定结果。生物样品中内源性产物的产生，势必与实验过程中酶反应的产物“混淆不清”；样品中其他内源性产物或药物，也往往在测定中“以假乱真”。以ATP磷酸核糖基转移酶为例，酶反应产物N-1-(5′-磷酸核糖基)ATP的紫外最大吸收在290nm，若反应液中有tRNA存在，必将干扰紫外分光光度法的测定结果。这些情况，只有应用放射化学测定法方可避免，因为样品中内源性产物或药物并不具有与被测产物相同的特征（放射性）。同样，用放射化学测定法研究酶的产物抑制作用时，尽管要在反应液中加入较多的非标记产物，也不影响放射性产物的测量。因此，酶的放射化学测定法特别适用于粗提液或生物体液中酶活性的测定，也适用于激活剂、抑制剂和酸碱度等因素对酶反应影响的研究。
(3)简便、快速： 常用的酶活性测定法往往偶联一个或两个其他酶反应。为了得到足够的精确度，要在反应系统中加入100倍过量的第一个偶联酶和10,000倍过量的第二个偶联酶。而放射化学测定法除个别场合外，一般不用偶联其他酶反应。应用一般酶活性测定法时，为了排除生物样品中内源性物质的干扰，往往要增加不少实验步骤，而放射化学测定法则没有这种必要。
但是，酶的放射化学测定法也有不足之处。因为本方法中有标记产物与剩余底物的分离一步，给方法的自动化增添了困难。此外，应用3H或14C标记底物时可能出现同位素效应，表现为对最大反应速度Vm和酶的米氏常数Km有影响，但这并不影响放射化学测定法的一般应用。
酶的放射化学测定法的应用 六大酶类中的每一类酶都可用放射化学测定法测定其活性，这些方法已普遍应用于生物化学的许多分支。目前有两个趋向值得注意：
❶由于这种方法简单、快速、准确，临床生化工作者最乐于采用，可望很快成为临床诊断和监测疗效的常规手段。尤其是某些先天性疾患，往往表现为某些酶的减少，而血或组织中这种低水平酶的测定，更有赖于放射化学测定法。此外，方法灵敏度高，取样量很少（穿刺法所取的活组织量已足够），更为病人所欢迎；
❷这种方法已应用于分子生物学，发展也很快。
总之，经过近二十年的发展，对很多的酶建立了简单、快速、灵敏度高、特异性强的放射化学测定法，今后还将继续扩大它的应用范围，并将在临床生物化学、分子生物学、分子遗传学和药物作用原理的研究等方面发挥更大的作用。