致敏试验

某些环境毒物通过一定途径作用于机体，可刺激机体产生特异免疫性，当再次接触同样物质时，可出现敏感性增高的现象，称为致敏。具有致敏作用的物质称为致敏原（变应原）。在人类生活环境中有不少致敏原。致敏试验是为鉴定受试物是否具有致敏作用及其作用强度的试验，一般可采用动物实验法。
化学物质致敏作用的本质是一种病理性免疫反应 （变态反应）。生活环境中一般低分子量的化学物质，不具备完全抗原的性质，但有些具有半抗原性质，进入机体后，能与机体蛋白质分子发生共价结合，形成较稳定的大分子半抗原载体复合物，就具有完全抗原性质而引起特异性免疫反应。机体产生变态反应的过程可分三个阶段。
❶致敏阶段（感应阶段）。致敏原通过一定途径对机体初次作用；
❷潜伏期阶段（反应阶段）。被致敏的机体需经一定潜伏期使机体对该物质产生特异免疫性 （特异抗体或致敏淋巴细胞），并达到一定水平而处于超敏感状态。
❸激发阶段（效应阶段）。此时机体再次接触该物质时即出现特异的病理性免疫反应。因此，致敏试验也可按下列基本顺序进行： 首先对实验动物注射 （或皮肤涂擦及其他途径）致敏量的抗原（受试物）一次或多次；经过一定时间的潜伏期，一般较短，有时需3～4周或更长；然后作激发试验，即再次注射（或皮肤涂擦）一定量的抗原（受试物），观察是否产生变态反应所特有的病理现象。
根据反应出现的速度，发病机理和特点，化学物质的变态反应可分为两类： 速发反应和迟发反应(见表1)。速发反应还可分过敏反应型、细胞溶解型及免疫复合物反应型。致敏原由呼吸道吸入的，常引起速发性变态反应；经皮肤进入体内的，则常引起迟发性变态反应。实验方法也可分为这两类。致敏试验的一般要求：
(1) 动物选择： 不同种属的动物对致敏原作用的反应差别甚大，豚鼠对各种致敏原均较敏感，兔无接触性致敏，但有较好的速发反应，大鼠和小鼠难发生接触性致敏，狗对两类变态反应均可发生。故两类试验均首选豚鼠，其次为兔、大鼠和狗等。
同一剂量可选用10个以上动物作实验。

表1 两类变态反应的特点

分类	机 理	主 要 病 变	特 点
			抗 体	被动转移	反应出现时间
速发反应	与体液抗体有关	过敏性休克、荨麻症、哮喘、溶血 性贫血、血小板减小症、类风湿 性关节炎等	免疫球蛋白游离 存在于血浆中	用血清	数分钟至数小时， 一般6h达顶点
迟发反应	与致敏淋巴细胞 有关	接触性皮炎、各种类型剥脱性皮 炎、肝脏炎症等	致敏淋巴细胞反 应	用细胞	1～4d，一般24～ 48h达顶点

(2) 致敏原的制备： 实验用物质应尽量采用纯度最高的产品。用粉剂致敏效果不佳，需配成溶液。水溶性物质用生理盐水或蒸馏水稀释，脂溶性毒物可用丙酮、二甲基亚砜、乙醇作稀释剂。致敏原使用前常加入佐剂或蛋白质类结合物，以增加其抗原性。
(3) 致敏途径： 致敏途径应尽可能与生活中人体接触方式相符，可采用涂皮、皮内、皮下、腹腔注射以及吸入等。皮内和皮下注射以耳、足掌和背部皮肤多用，涂皮以背、颈和耳部皮肤多用。在研究空气污染物的致敏作用时，常采用吸入途径。
(4) 剂量选择和染毒时间： 化学物质的致敏作用虽不同于一般的毒性效应，但实验证明致敏作用也遵循着某种剂量一反应规律。致敏率和过敏反应强度与致敏原的剂量和作用时间有关。只有在体内或皮肤局部存在一定量的致敏原，经一定时间才能使机体出现致敏状态，此后再遇该物质时即可发生变态反应。但致敏原量过大如用中毒量反而可抑制变态反应过程，局部过分强烈的刺激，也可妨碍结果和正确判断。所以致敏剂量须作预备试验确定，一般选用不引起全身中毒和局部严重刺激的最大剂量作为最高剂量，并设2～3个低剂量。速发型实验的激发剂量可以用致敏剂量的3～10倍经静脉或腹腔注射。
染毒时间： 有一次法和重复法两种。重复法可每天一次或隔日一次，连续3～10次；或采用皮内或皮下注射一次，一周后再涂皮一次的混合法。激发试验一般在最后一次致敏染毒后1～4周进行。
(5) 反应结果的判定： 对迟发性反应实验，经皮处理时，局部反应在24～72h内出现明显的硬结及红斑为阳性反应，可根据激发试验后作用部位的肉眼观察所见判定，五级评分(见表2)。
对速发型反应的判定，主要应在激发注射后仔细观察其迅速出现的各种症状表现(见表3)。
根据上述实验动物最敏感组的阳性发生率（致敏率），可将化学物质的致敏作用强度分为5级(见表4)。
近年来鉴于上述动物试验存在着若干缺点，如实验结

表2 局部反应强度评分标准

局 部 反 应	评分
未见任何异常改变 仅在注射针孔处轻微发红 红斑在0.5cm以上，无硬结	0 1 2
红斑在1cm以上，中间可触知0.5cm以下 的硬结	3
红斑在1cm以上，硬结在0.5～1cm，有轻 度水肿	4
红斑超过1.5cm，硬结在1cm以上，水肿， 灶性坏死超过0.5cm	5

表3 速发型过敏反应强度分级

症 状 表 现	评分
耸毛，抓耳搔脸，不安 除上述症状外，发生颤抖、喷嚏、呼吸急促	1 2
除上述症状外，出现大小便失禁、呼吸困难、 无目的环转运动、烦躁不安	3
除上述症状外，出现肌肉痉挛、侧卧，但未致 死	4
出现上述症状，最后死亡	5

表4 化学物质致敏作用强度分级

变态反应阳性反应率%	评分	致敏作用强度分级
～10 11～30 31～55 56～80 81～100	1 2 3 4 5	弱致敏物 轻微致敏物 中等致敏物 强致敏物 极强致敏物

果常受原发刺激的干扰，反应结果的评价多少带有一定的主观性，动物种属及个体差异很大等。因而提出了一些体外试验的方法，如淋巴母细胞转化试验，巨噬细胞移动抑制试验以及周围血细胞酶活性的测定等，都值得进一步研究。