胚胎技术embryo technique

对胚胎进行人工操作和（或）改造的技术。根据对胚胎进行操作的阶段，方法和目的的不同，胚胎技术分7个方面：❶体外受精；
❷胚胎冷冻；
❸胚胎分割；
❹胚胎融合；
❺卵核移植；
❻外源基因导入；
❼胚胎性别鉴定。
体外受精 将卵子和精子从体内采集后，在体外一定条件下进行受精，形成受精卵的过程。“试管动物”就是将体外受精后的受精卵移植到受体动物产生的后代。体外受精不仅对探索受精这一生命现象的奥秘具有重要意义，而且在临床医学和畜牧业生产上也有广阔的应用前景，如克服不孕，精子质量鉴定和充分利用优良种畜等。哺乳动物体外受精的研究始于19世纪末，但直到1951年张明觉和奥斯汀(C. R. Austin)发现精子获能现象后，才进入一个划时代的发展时期。自1959年张明觉首次获得世界上第一胎“试管小兔”后，至今已有仓鼠、小鼠、人、长爪沙鼠、猫、豚鼠、猴、大鼠、狗、牛、绵羊、山羊、猪等21种哺乳动物的体外受精相继获得成功。其中获得“试管动物”的先后为家兔、小鼠、大鼠、人、牛、山羊、绵羊和猪。中国于1986年首次报道小鼠和家兔体外受精获得成功并得到“试管动物”，1988年首例“试管婴儿”诞生。体外受精的主要技术包括：
精子获能处理 雄性动物射出的精子，只有当它们在雌性生殖道中停留一段时间，在形态和生化方面发生一系列变化后，才具有同卵子结合的能力，这种现象叫做精子获能。目前，用于体外获能的方法主要是一些化学或生化试剂处理法，如用高渗盐溶液、人工合成输卵管液(SOF)或其它类似培养基、钙离子载体(A23187)和肝素等。
卵子的准备 用于体外受精的卵子来源有卵泡卵（从卵巢的卵泡内采取）、卵巢表面卵（从卵巢表面回收）和输卵管卵（排卵后进入输卵管的卵子）。后两种卵都是成熟卵，可直接用于体外受精。但卵泡卵有成熟和不成熟的，未成熟的卵子须经体外培养，待其成熟后才能用于体外受精。卵子的体外培养可在F10或TCM199等培养基内进行。
体外受精处理 把成熟的卵子和经获能处理的精子放在体外受精培养液中一起培养。培养环境一般为含5%CO2的空气，相对湿度为100%，培养温度应与所试动物的体温相近。在相差显微镜下检查受精情况。受精的标志是可见第二极体，胞质内有两个原核或有脱落的精子尾部。
受精卵移植 更换培养液，受精卵进一步发育为2细胞至胚泡期胚，用作移植，产生后代。
胚胎冷冻 采用冷冻保护剂和适宜的降温速度冷冻胚胎，并将其投入液氮(-196℃)中保存。此项技术不仅使建立动物基因库的设想变为现实，也为远距离运输胚胎和随时随地进行胚胎移植提供了方便。自20世纪50年代精液冷冻保存成功之后，许多学者对动物胚胎冷冻保存开展研究。惠廷厄姆 (D. G.Whitting-ham)等于1972年通过移植冷冻和解冻后的胚胎，成功地获得了小鼠后代。胚胎冷冻又相继在牛、家兔、绵羊、大鼠、山羊、马等以及人体上获得成功。目前，美国、英国、加拿大、澳大利亚、法国等已将该项技术应用于畜牧业生产，并建立了商业性的冷冻胚胎库，向世界各地出售冷冻胚胎。中国1982年首先在绵羊上获得冻胚移植的羊羔，随后，家兔、奶牛及山羊胚胎冷冻相继获得成功。
胚胎冷冻的主要程序：
冷冻保护液的配制 由普通冲卵液 (杜氏磷酸盐缓冲液+10～20%犊牛血清，简称PBSS)加入一定浓度的冷冻保护剂配制而成。目前，所用的冷冻保护剂有甘油、二甲亚砜(DMSO)、聚乙烯吡咯酮(PVP)、乙二醇和1.2-丙二醇等，其中甘油最为常用。
冷冻方法 将胚胎置于有冷冻保护剂的溶液中平衡数十分钟，装入细管或安瓿冷冻。方法有： ❶乙醇浴降温法；
❷冷冻自动控制程序机控温冷冻；
❸简易冷冻仪冷冻；
❹直接投入液氮法。
解冻及移除冷冻保护剂 将装有胚胎的细管或安瓿从液氮中取出后，迅速投入20～38℃的水浴中解冻。移除冷冻保护剂的方法： ❶逐步移除法。用冷冻保护剂浓度逐级(3～4级)递减的冷冻保护液处理，使胚胎中的冷冻保护剂含量逐渐减少，最后将胚胎移入PBSS以彻底移去冷冻保护剂；
❷两步移除法。用蔗糖、冷冻保护剂和PBSS配成两种溶液，第一种含三种成分，第二种不含冷冻保护剂，依次用这两种溶液处理即可移去冷冻保护剂；
❸一步移除法，用蔗糖和PBSS配制的溶液一次处理胚胎，以除去冷冻保护剂，移除冷冻保护剂的胚胎即可用于移植；
❹铃木达行（日本）建立的“直接解冻移植的一步塑料细管法”，在生产中也已应用。
胚胎分割 使用显微操作仪（见显微操作技术）对胚胎进行人工分割的一种技术。通过分割可由一枚胚胎产生几个遗传性能相同的分割胚，经移植，可发育为若干个表现型相同的后代。此项技术无论对发育生物学等基础研究，还是对畜牧业生产实践均有重要价值。马伦(R.J.Mullen)等于1970年首次分离2细胞胚获得了小鼠同卵双生后代。随后，威拉得逊(S. M.Willadsen)等于1979年将该项技术成功地用于家畜，先后获得了同卵三生犊和同卵四生绵羊羔。至目前为止，胚胎分割相继在绵羊、牛、兔、马、山羊等动物上获得成功。在发达国家，胚胎分割技术已应用于畜牧业生产。中国于1983年开始此项技术的研究，1986年，小鼠胚胎分割成功，1987年，山羊胚胎分割又取得成功。继之，绵羊、牛和家兔胚胎分割也相继成功。1988年，张涌等将胚胎冷冻技术和显微分割技术有效地结合使用，在中国首次完成小鼠冷冻胚胎分割；1989年又完成山羊冷冻胚胎分割。
威拉得逊在制作家畜同卵双生后代时所使用的胚胎分割方法程序比较复杂，以后，许多研究者在简化胚胎分割程序上作了大量工作，逐渐形成了目前常用的两种方法，即显微玻璃针分割法和显微手术刀分割法。另外，还有用显微手术刀直接二分透明带和胚细胞团，不装透明带移植的简化程序，也获得很好的效果。冷冻胚胎的分割方法基本上与新鲜胚胎的分割法相似，但如先切割、后冷冻，则在冷冻之前需将半胚用双层透明带或琼脂包埋，起保护作用。
胚胎融合 将几种不同种或不同品系的动物胚胎嵌合在一起，由此发育为一个嵌合体后代。采用此项技术可以创造更多具有高度杂种优势的新畜种，获得大量能为人类提供更多更好畜产品的家畜和稀奇的观赏动物； 嵌合体还是哺乳类动物发育生物学有用的研究材料。胚胎融合的研究开始于20世纪60年代初塔克夫斯基(A.K. Tarkowski)等于1961年首次报道获得嵌合体小鼠； 匹格赫斯(E. Pighills)于1968年成功地创造了嵌合体绵羊。70年代以来，胚胎融合已分别在大鼠、山羊、牛等动物上取得成功，获得嵌合体后代；并在绵羊和山羊、黄牛和瘤牛上获得种间嵌合体后代。在中国，1981年首次报道获得昆白鼠胚和C57鼠胚的嵌合体后代。
胚胎融合方法主要有两种： ❶聚合法，在体外培养条件下，用石蜡油挤压法迫使两个以上的去透明带裸胚(或半胚、或部分胚细胞)粘合在一起发育，然后移植；
❷胚泡腔注入法，将分离的若干卵裂球或内细胞团用显微吸管注入受体胚泡腔内，然后移植。采用分割后将内细胞团和滋养层一起注入另一胚泡腔的方法也可获得嵌合胚后代。
卵核移植 将原核期受精卵细胞中的原核去掉，再注入另一新核代替，故又名卵核置换。通过这种方法可使一个优良胚胎产生数十个优良后代。这不仅对加速优良畜种的繁育有重大实践意义，而且对发育生物学等基础研究也有重要科学价值。此项研究开始于20世纪70年代后期，霍佩 (D. C. Hoppe),1977年在世界上首次获得单性生殖仔鼠。伊尔门西(K.Illmen-see),1981年首次用机械方法，成功地获得一批移核仔鼠。此后，卵核移植分别在牛和绵羊上也获得成功。
卵核移植的方法主要有两种： ❶机械法，将供体细胞和受体受精卵用一定浓度的秋水仙碱和细胞松弛素B处理，用显微吸管吸去受精卵中两个原核，用显微吸管吸取供体细胞的核，将供体细胞核注入去核受精卵内，体外培养或直接移植；
❷融合法，前1～2步骤与上法相同，从供体胚中吸取胞核或细胞，并将其注入去核受精卵的卵周隙，用齐默尔曼 (V.Zimmer-man) 电融合器促进胞核或供体细胞与去核受精卵融合，体外培养或直接移植。在本法中，如在注入核或细胞的同时，注入一滴灭活仙台病毒溶液或聚乙二醇也可代替电融合器的融合。
基因导入 将外源性基因注入受精卵雄原核中的胚胎技术。它对加速畜种改良，提高家畜生产性能具有十分重要的作用。1980年戈尔登 (J. W.Gordan)等首次报道了在小鼠胚胎原核中注入DNA片断的成功。1985年哈莫(R.E. Hammer)等采用该技术首次获得基因转移兔、绵羊和猪。到目前为止，此项技术还存在着注入基因的整合率很低，表达率更低的突出问题。
技术环节有三个方面： ❶被导入基因的选择必须满足三个条件，即能与受体细胞核整合，应能遗传，应能表现功能，被导入的基因结合于一个载体上后才能用于注入；
❷基因注入一般选择原核形成期的受精卵，对于猪、牛、羊等动物的受精卵，在注入前需经离心处理，否则不易见到原核；
❸培养及移植与体外受精卵的培养和移植方法相同。
胚胎性别鉴定 在胚胎早期通过某些检测手段确定胚胎性别的技术。它不仅对生殖生物学、发育生物学等基础研究有重要意义，而且在未来的畜牧业生产中也有广阔的应用前景。鉴定方法主要有三种：
染色体组型分析法 通过显微手术从囊胚的滋养层中取出一部分细胞用于染色体分析，胚胎其他部分或冷冻或在体外培养，待确定性别后，再决定该胚是否被移植。
DNA探针鉴定法 从早期胚胎中取出10个左右细胞，然后将胚胎冷冻，用DNA探针识别性染色体上的DNA序列，就可鉴定胚胎的性别。
免疫鉴定法 主要根据H-Y抗原决定性别学说，用该抗原的抗血清检查确定胚胎是否携带H-Y抗原，并据此确定胚胎的性别。它又分两种鉴定方法： 一是细胞毒性试验，将胚胎在加有补体和抗血清的培养液中孵育一定时间，携带H-Y抗原的胚胎发生溶解、变性、死亡，而H-Y抗原阴性则不然； 二是间接免疫法，此法需第二抗体，胚胎相继与一抗和二抗进行孵育，然后在荧光显微镜下检查胚胎是否带有荧光，带荧光者多为雄性胚，不带荧光者多为雌性胚。
免疫鉴定法由于抗血清的效价低，至今技术还不稳定。而DNA探针鉴定法，可靠率可达95%以上。
胚胎技术的研究给人类社会带来一些新问题，例如在疾病传播方面，胚胎冷冻技术促进了胚胎的国际商品化和向世界各地的广泛运送，这就可能通过胚胎移植广泛传播疾病。胚胎传播疾病可能有三种情况：❶胚胎内部带有病原体，即病原来自卵子或精子；
❷透明带内部或表面带有病原体；
❸胚胎移植所用的液体中带有病原体。为防止通过胚胎移植传播疾病，胚胎移植国际动物传染病事务局(OIE)多次开会研究胚移疾病传播的问题，要求建立适宜于检查胚胎的病原体诊断方法。1981年，联合国粮农组织建议进口胚胎的国家，应选择未感染过各种主要病毒病，且未接种过疫苗的母畜作受体，移植后隔离一年； 对所生后代也应隔离三个月，并进行详细检疫。国际胚胎移植学会建议，对胚胎移植中心或提供出口胚胎的单位都应由兽医部门进行严格的卫生监督。日本在1983年已将胚胎定为法定检查对象； 法国对进口胚胎制定了明确的卫生监测和要求； 中国对进口胚胎也进行了相应的检疫。在对社会伦理道德及法律的冲击方面，体外受精技术的发展使人类 “代生母” 的数目不断增多。“代生母” 及婴儿的商品化还会导致现行法律难以裁决的民事纠纷，从而给社会带来不安定因素。随着胚胎技术的发展，胚胎冷冻、分割、性别控制等技术也有可能被应用于人类生殖过程中，这将带来更为严重的社会争议。
但是，目前尚有不少人关注和支持胚胎技术的发展及其在人类生殖过程中的正确应用。因为胚胎技术已经、正在或将要在人类计划生育、优生优育中作出贡献。

胚胎技术embryo technique

对胚胎进行人工操作和（或）改造的技术。根据对胚胎进行操作的阶段、方法和目的的不同，胚胎技术分为：
❶体外受精；
❷胚胎冷冻；
❸胚胎分割；
❹胚胎融合；
❺卵核移植；
❻外源基因导入；
❼胚胎性别鉴定。胚胎技术的研究也给人类带来一些新问题，如胚胎冷冻技术促进了胚胎的国际商品化和向世界各地的广泛运送，这就可能通过胚胎移植广泛传播疾病；体外受精技术的发展使社会上“代生母”增多，“代生母”及婴儿的商品化会导致现行法律难于裁决的民事纠纷；胚胎冷冻、分割、性别控制等技术有可能被应用于人类生殖过程中，这将带来更为严重的社会争议，但在人类计划生育、优生优育中有重要的作用。