细胞荧光光度术

细胞荧光光度术又称显微荧光光度术、定量荧光显微术。这是一种荧光光度术和镜检技术结合，在镜检的分辨水平上进行物质定量和定性荧光分析的技术。它已成为组织化学和细胞化学研究中广泛用于测定物质和细胞器内核酸、氨基酸、蛋白质、糖元、生物胺等含量的手段。它灵敏度高，比测吸收光高2～4个数量级。荧光物质受激后本身就是发射光源，在测定不均一分布的发色团时，不存在分布误差的问题，测定方法简单。
细胞荧光光度计 由荧光显微镜、光度测量系统(测量光阑、光电倍增管

图1 细胞荧光光度计光路系统
1.观察照明灯 2.橘红或红色滤光片3.反射镜 4.聚光器 5.载物台 6.样品 7.物镜 8.双色束分离器 9.阻断滤片 10.测量光阑 11.可滑动的反射镜用于改变光路到目镜或光电倍增管 12.观察目镜 13.激光光源 14.吸热片 15.视场光阑 16.激发滤片 17.光电倍增管

和单色仪等) 和光电系统 (光电倍增管、高压电源、指示仪器及电快门等) 三个部分组成(图1)。
细胞荧光光度术是通过测定显微镜下的像来实现的，像的反差和光强度十分重要，因此需用强激发光源照射样品。激发光的波长要尽可能接近荧光反应产物的吸收峰，这就要求对光源和滤片有所选择。为了防止激发光对显微镜下样品的影像干扰，需在物镜后另加一个阻断滤片。
(1) 光源： 常用50W或100W汞灯、75W和150W氙灯。汞灯在366、405、436和546nm处有强辐射线，这些波长比150W氙灯亮度高2.5倍。有时也可用石英钨卤素灯作为激发光源。在定量测定荧光时，电源要求稳定度高。一般可选用钨丝灯或钨卤素灯，为防止样品发生荧光消退可加用长波段滤片（红色或橙红色）。
(2) 激发滤片： 滤片置于光源和聚光器 （落射光照明时为物镜） 之间。用于选择激发光的波长范围。滤片有三种： 色玻璃、长波通干涉滤片和短波通滤片，一般荧光染料和荧光发色团的主要激发光谱相当宽，当需要得到强的荧光信号时，常用宽带通干涉滤片(半宽大于20nm)。当样品的激发光谱的峰和荧光发射光谱的峰相当靠近时，可用窄带通干涉滤片，或用长波通和短波通组合的滤片。
(3) 照明系统： 有四种形式，透射光暗场或明场，落射光暗场或明场。目前应用最广泛的是落射光明场照明。
落射荧光垂直照明器的结构见图1，由激发光源发射的光通过激发滤片投射到与光轴呈45°角的双色束分离器上，激发光被反射到物镜中，物镜作为聚光器，使激发光聚焦在样品上。样品产生的荧光以及由物镜表面和盖玻片表面反射的激发光同时进入物镜，反回到双色束分离器，双色束分离器对波长短的激发光有很强的反射能力，但却能通过波长较长的发射荧光，使激发光和荧光分开，透过的残余激发光被阻断滤片进一步吸收。用不同的激发滤片，双色束分离器，阻断滤片的组合，即可满足不同荧光反应产物的需要。
(4)物镜： 荧光显微术的效率与所用物镜的数值孔径的4次方成正比。在落射光照明时，由于样品的照明和荧光的收集是由同一个物镜来实现的。因此用数值孔径大的浸没(水浸、油浸) 物镜为好。透射光暗场照明时，一般用低或中倍干物镜。
(5) 阻断（次级）滤片：长波通滤片又称截止型滤片，只使长于某种波长的光通过，阻止激发光通过。另一种为窄带干涉滤片。
(6) 光度计系统：测量光阑位于样品中间象的平面上，用于限定样品测定的范围，可根据样品的形状，大小选用不同的圆形或矩形测量光阑。根据观察目镜调节载物台使被测样品移至测量光阑内。
仪器使用原理 具有荧光发色团的物质被光激发后，发射荧光，荧光强度(F)和荧光发色团的浓度(C)的关系用下列公式表示：
F=I₀Q(1-e-^eed)
式中F为发射荧光强度、I0为入射光强度，Q为荧光量子产率，ε为荧光发色团的克分子消光系数，c为荧光物质的浓度，d为物体的厚度。
式中，I0数值用稳定的激发光源保持恒定。在一定的荧光物质与恒定环境条件下，Q值维持不变。因此随着荧光物质浓度(c)的增加，荧光强度(F)也随之改变(图2)。由图中可见，只有在荧光物质浓度低时，F和c呈近似直线关系。如达到一定浓度或荧光被重吸收时，F和C之间就失去了线性关系。所以荧光定量测定常在低浓度情况下进行。
使用仪器时，滑

荧光物质浓度(c)

图2 荧光物质浓度与荧光强度的关系曲线a表示不能达到的“理想” 线性关系，b代表在没有重吸收情况下的指数函数，曲线c为当必需考虑到再吸收时，二者间的关系

动反射镜移开光路使光进入光电倍增管。有些细胞荧光光度计测定光阑作为一个照明光点叠加在样品的像上，通过目镜就能定位测定样品。荧光的相对强度能在数字电压表上显示出来。为了防止长时间激发光照射样品而引起的荧光消退，可用长波段透射光寻找到被测样品，通过电快门控制系统，关闭透射照明光路，打开落射激发光快门，激发光在短于一秒钟内照射样品。
生物材料制备 涂片、冰冻切片的任何组织和直接生长在载玻片、盖片上的培养细胞和细胞悬液均可进行荧光染色制备。染色前先进行固定。常用固定液为甲醇、甲醛、冰醋酸(85:10:5V/V)的混合液，或用乙醇、乙醇-乙酸。固定后染色如使用DNA的典型孚尔根反应和雪夫型试剂时，样品必须经过酸水解； 菲啶溴红(EB)和碘化丙啶(PI)染色则不需水解。蛋白质染色可用碘胺黄素(Sulfalavine)、异硫氰酸荧光黄(FITC)。
生物学和医学中的应用 在生物学和医学中细胞荧光光度术既可用于测定原发荧光，也可以更广泛地用于测定诱发荧光。测原发荧光即是测定未经处理的生物样品被光激发后自身所发射的荧光，例如弹性或胶原纤维、还原型辅酶I(NADH)等。诱发荧光可以通过化学反应使组织中某些组分转换为荧光物质。如甲醛或醋酸能诱发生物单胺类物质形成异喹啉醌类或B-卟啉等荧光物质。也可以通过酶诱发荧光，如细胞内酯酶可催化不发荧光的二醋酸荧光素为荧光物质——荧光素。也可通过外加荧光染料诱发荧光，如吖黄素(acriflavine)与DNA结合使DNA发荧光。如果使荧光染料和抗体结合后再与相应抗原反应，形成抗原一抗体复合物，经光激发后发射荧光可以检测某些抗原。
细胞荧光光度术应用范围较广，它可以测定细胞内各种组分如DNA、RNA、组蛋白、总蛋白、各种氨基酸、糖元等的含量； 免疫荧光的定量测定； 神经递质如儿茶酚胺、5-羟色胺、多巴胺等的定量测定； 也可作为酶动力学研究手段。