细胞同步化

细胞同步化是指自然发生的或人为造成的细胞处于同一细胞周期时相。在周期中同步的群体叫做同步化细胞群体。自然条件下，绝大多数增殖性细胞群体在周期中是非同步的，叫做随机细胞群体。为了深入研究细胞周期各时相中发生的变化及调控机制，常需分别对细胞周期的不同阶段进行某种生化分析或细胞生物学的其他研究。运用单个细胞进行工作在技术上是难以办到的，而依靠自然同步的细胞群体又相当有限。因而需要人工造成细胞的同步，以便获取时相均一的细胞集团。这就导致了各种同步化方法的相继产生。
近20年来，利用各种手段，使用各种材料，进行人工同步化的工作有很大进展。这有力地促进了细胞周期研究的深入。许多关于细胞周期的知识，如细胞周期中RNA的合成，细胞表面的变化，各种酶活性的消失，环磷酸腺苷 (cAMP)水平的变化，核蛋白的变化都来自于用同步化细胞群体进行研究的结果。由此可知，细胞同步化技术对细胞周期的研究有着十分重要的意义。除此之外，某些其他与细胞周期有关的研究，如抗肿瘤化疗药物作用机制的研究也需要同步化细胞群体。还有人提出，如能在体内诱导出细胞同步化，将可提高肿瘤化疗和放疗的效果。
自然同步化 在某些生物发育的一定阶段中有部分的或短时间的细胞同步化现象。利用这些材料曾在细胞周期的研究上进行过不少工作，同人工同步化相比，它们的优点是未经任何理化因素的干扰。
在细胞周期研究中常用的自然同步系统有以下几类。
某些水生动物受精卵的同步分裂 数以克计的海胆卵可以同时受精，其最初的三次分裂同步性是极好的。利用第一次分裂的同步性可大量地分离出有丝分裂器进行研究。海参的卵在受精后一直到512个细胞阶段为9次同步分裂。
多核体 粘菌是一个仅有核分裂而不伴有胞质分裂的原生质团，同一细胞质中含有数以千计的核。所有核反覆同步通过细胞周期，最终数目可达10⁸ (原生质团大小可达5—6cm)。将原生质团切成许多小块，各个断片中的核分裂仍然同步，但不同断片之间核分裂不同步。
种子植物胚乳形成时，在核先行分裂而细胞壁的形成延迟时，和粘菌的情况一样，进行同步核分裂，有的可达32个核。
增殖抑制解除后细胞的同步分裂 将细菌、霉菌休眠孢子移入营养环境，它们一齐开始发芽，进行同步分裂。由于休眠孢子容易大量收集，可用于生化研究。如配合人工处理，在培养基中加入氨基丙酸和鸟嘌呤以提高发芽率，或用热休克法(60℃,30分钟)可以提高同步化程度。
某些再生系统，如哺乳动物肝部分切除后的再生肝，其最初的细胞分裂具有一定的同步性。
正常的动物培养细胞当长成致密单层时，细胞就阻留在G₁期或G₀期。如换以新鲜培养基重新接种，可将细胞从阻留中解脱出来。解脱后数小时，有很高百分率的细胞以相当程度的同步性进入DNA合成。
细胞同步化程度 判断细胞是否同步化可采用以下几种方法：
❶测定细胞的生长曲线：同步生长的细胞应该呈现梯形生长曲线。
❷测定有丝分裂指数(MI)曲线：同步生长的细胞MI曲线应该峰谷明显。
❸测定³H-TdR标记指数曲线：以观察细胞DNA合成的同步情况。
❹测定各期细胞在整个群体中所占百分比：可用流式细胞光度术，其原理是利用细胞DNA含量组方图计算G₁、S、(G₂+M)各期细胞的相对含量。也可用早熟凝集染色体(PCC)实验，其原理是利用早熟凝集染色体的形态确定间期核在周期中的位置。
衡量一个同步化细胞群体同步化程度高低可从以下两方面因素考虑：
❶在整个细胞群体中同步化细胞所占百分比。
❷同步化细胞分布时间区带的宽窄。如MI为90%的细胞群体，同步化细胞占整个细胞群体的90%。同步化细胞纯度越高，分布时间区带越窄，同步化程度越高。最理想的同步化是所有细胞均处于细胞周期同一点上，但这在实际中很难做到。
除了多核体，任何同步化细胞群体的同步性均随周期的进行逐渐丧失。这是由于细胞之间细胞周期时间(t_o)的差异引起的，其中G₁期时间 (t_G2) 的差异起主要作用。
人工同步化原理及分类 已建立的体外培养细胞同步化方法按其原理可分为两类。一类是利用细胞物理特性的差别选择细胞周期某一阶段的细胞，这样的方法叫做选择同步化。另一类是通过阻断细胞的某一代谢过程将细胞阻断在细胞周期某一阶段然后释放。这样的同步化叫做诱导同步化。前者的优点是操作过程不严重影响代谢过程，因而所得同步化细胞群体接近于自然情况；缺点是仅能获群体中很小一部分细胞。后者的优点是同步化程度较高，细胞收获量较大。但由于阻断的仅是某一代谢过程，所以在此代谢过程被阻断的同时，其他代谢过程可能仍然进行，因而导致不均衡生长。而且长时间阻断某一代谢过程，可能造成细胞某些结构、功能的异常。这些均使阻断所获细胞群体不同于正常细胞群体，给实验结果的解释带来一定的麻烦。
选择同步化 主要有以下几种。
(1) 有丝分裂选择法：可用单层培养的细胞来进行，利用单层培养细胞在M期变圆、隆起，与培养瓶的附着性降低这一特点，选择收集有丝分裂的细胞。此法收获的M期细胞MI可达95%以上。此法的优点为细胞不受药物等的伤害，所获细胞同步化程度高，分布于M期这一狭窄的时间带中。缺点为细胞收获量小，每次仅可收集1—2%的细胞。
此法是使用最多的一种，但只适用于单层生长的细胞。
(2)细胞沉降分离法： 由于细胞在其周期过程中体积逐渐增大，所以处于细胞周期不同阶段的细胞体积不同。而细胞在某一离心力场中的沉降速率与其半径平方成正比，因此可用沉降法分离因所处周期时相不同而大小不同的细胞。
将高密度单细胞悬液置于事先制备好的蔗糖密度梯度之上，然后离心沉降或重力自然沉降。由于大小不同的细胞沉降速率不同，因而在蔗糖密度梯度中分层分布，大细胞在底部，小细胞在顶部。分层收集即可得周期不同时相的细胞。在实际运用中，多收集顶部的小细胞(收获量约为5%)，此为刚完成有丝分裂的细胞。
此法的优点是可适用于任何系统包括悬浮生长的细胞。存在的问题为同步化程度有限。这一方面是由于分离过程不够完全，另一方面同一时相的细胞大小并非都一致。有人还提出所使用的密度梯度介质可能对细胞的代谢有影响。
(3) 离心淘洗法： 根据细胞体积不同可分离周期中不同阶段的细胞。此法仍是根据细胞的沉降速度与细胞体积有关这一原理，但需专门设备——离心淘洗转子。细胞在离心淘洗转子中被分成体积不同的各分部。由于分离效果较上面的方法好，被分离的各分部均可收集使用。这样可在短时间内从一个细胞群体中同时获得G₁期、S期、(G₂+M)期同步化细胞群体，是一种比较理想的选择同步化方法。
(4)高比度³H-TdR选择性杀伤法：一定剂量 (约1μCi/ml) 的高比度³H-TdR可选择性杀伤与其接触时正处于S期的细胞。这是由于TdR仅掺入S期细胞核中。掺入核中的高比度₃H-TdR可因辐射损伤造成细胞增殖死亡。
在一对数生长期细胞群体中加入一定剂量的高比度³H-TdR,S期细胞首先被杀伤，以后随细胞周期进行，不断有G₁期细胞进入S期被杀伤。当高比度³H-TdR作用时间接近并小于t_G1+t_Ga+t_M时，整个群体中只剩下一小部分接近S期的细胞存活。此时中止高比度³H-TdR的作用(加入高浓度TdR，阻止³H-TdR的继续掺入)可得到一个同步化细胞群体。
此法的优点是操作简单，所收获细胞群体未受代谢干扰。但由于与同步化群体混杂在一起的是一个虽然增殖停止、终将死亡但代谢尚未停止的群体，所以不能用于生化分析。
诱导同步化 主要有以下几种。
(1) DNA合成阻断法：选用DNA合成抑制剂，可逆地抑制DNA的合成而不影响其他期细胞，可将整个细胞群体阻断在S期、G₁—S交界处。5-氟脱氧尿嘧啶、羟基脲、阿糖胞苷、氨甲蝶呤、5-氨基尿嘧啶、高浓度AdR、GdR、TdR均可抑制DNA合成而使细胞同步化。比较而言，高浓度TdR对S期细胞的毒性较小，且阻断效果较好，因此成为较常使用的阻断剂。
TdR的最有效应用是双阻断法。将高浓度TdR(一般为2.5m mol/L)加入对数增殖期培养细胞介质中。由于DNA合成基本被抑制，S期细胞基本不前进，而其他期细胞前进至G₁—S交界处。此为第一次阻断。当洗涤细胞已去除高浓度TdR时，阻断很快被解除，细胞在周期中前进。当解脱时间>t_s时，所有细胞均已脱离S期，此时给予第二次阻断，即可使细胞积累在G₁—S交界处。这样的阻断方案仅适用于tG₁+t_G2+t_M>t_S的细胞，反之两次阻断之间不可能使所有细胞脱离S期（见下图）。

用过量TdR两次处理细胞周期同步化示意图

L.细胞群体在细胞周期中的正常分布；T1·用过量TdR处理一次；R.除去TdR;T2.第二次过量TdR处理。有黑点处有细胞分布，无黑点处无细胞分布

此法的优点是同步化程度较高，适用于任何培养体系，可将整个培养物完全同步化。缺点是诱导过程造成细胞非均衡生长(蛋白质、RNA合成并不停止，细胞体积增大)，因此所得同步化群体较正常细胞在周期上有一定的差异。如细胞周期各时相时间有所改变，有时出现有丝分裂和染色体的异常。
(2) 中期阻断法： 某些药物可抑制微管的聚合，因而抑制有丝分裂装置的形成，将细胞阻断于有丝分裂中期。同DNA合成阻断相比，中期阻断时非平衡生长的问题并不十分明显，这是由于M期细胞大分子合成基本停止。但阻断的可逆性较差，当阻断时间较长时，阻断释放后许多细胞不能完成正常的有丝分裂而进行异常分裂。因此在实际运用中，中期阻断法往往与其他方法配合使用以达到细胞同步化的目的。
秋水仙酰胺为秋水仙素的衍生物，其作用强、毒性小，用多种细胞实验的结果证明在一定的时间范围内阻断作用可逆，是细胞同步化中较常使用的中期阻断剂。若阻断时间长时，有些种类细胞可从阻断中逃逸。
由于秋水仙酰胺可将多种细胞阻断于M期，但释放后不能正常进入细胞周期而不能广泛利用。若干种简单的气体已被应用于动、植物细胞，以期获得大量的有丝分裂细胞。如在植物中应用丙烷(1.5atm),N₂O(6atm)，氮(80atm)，甲烷(40atm)，氩(75atm)，氢(200atm)等。Rao(1968)首次用N₂O处理HeLa细胞获得大量纯的M期细胞。将HeLa细胞接种于平皿中，在对数生长期经过一次2.5mmol/LTdR处理，时间长于，t_M+tG₁+t_S，洗脱后经一至数小时，再将细胞置于不锈钢缶中，充N₂O，压力80—85psi，内保持3%CO₂浓度，在37℃循环水浴中过夜，约10余小时，放气，取出平皿，用震荡法取出M期细胞，细胞可同步自G₁→S→G₂→M，不过同步效果逐渐下降。本方法是目前最常使用的同步化方法。N₂O的分子作用和机制目前尚未阐明。
(3)必需营养成分饥饿法：G₁期对必需营养成分的缺乏较其他时相敏感得多。因此当培养液中缺乏某种必需营养成分时，细胞在G₁期阻断。
断绝亮氨酸或异亮氨酸的供应，可将细胞阻断于G₁期。当补给所缺氨基酸时阻断解除，细胞以一定的同步性进入S期。
细胞接种后长时间不换液，由于营养因素和生长因子的缺乏细胞增殖停止。当换入新鲜培养液后细胞表现出一定程度的同步性。
设计合理的同步方案 在实际运用中应根据细胞本身的特性及具体的研究目的设计合理的同步化方案。一个同步化方案中可只包括一种同步化方法，也可有两种或多种同步化方法的配合使用。如用秋水仙酰胺短时间(2—4h) 阻断单层生长的细胞然后进行有丝分裂选择，一方面可提高M期细胞的产率，同时又可避免秋水仙酰胺长时间作用对细胞的毒害。用氨基酸饥饿法使细胞阻断在G₁期然后释放并同时用羟基脲抑制DNA合成，使细胞在G₁—S交界处重新同步化，可获得一个较好的同步化细胞群体。由此可见，不同的同步化方法配合使用可互相取长补短以提高同步化程度。
不同的细胞特性不同，包括细胞的贴瓶行为，对各种阻断剂的敏感性，细胞周期各时相时间的长短等等。这些都应作为设计同步化方案时加以考虑的因素。不同的细胞系对TdR的敏感性是不同的，如HeLa细胞需要TdR浓度达到2.5mmol/L才能抑制DNA合成，而对另外一些细胞系则需要高得多的浓度。还有些细胞则根本无效。因此，在设计同步化方案前，应进行必要的预实验，以搞清细胞的有关特性。
不同的研究对同步化的要求是不同的。有的研究要求同步化程度高，细胞收获量大，而有的研究要求所获同步化细胞能在周期中正常运转。对于不同的要求应设计不同特点的同步化方案。如PCC实验中M期同步化细胞主要起提供染色质凝集因子的作用，是否可继续正常增殖对实验关系不大，因此可采用长时间中期阻断然后进行有丝分裂选择的方法。而在某些实验中，进行M期同步化的目的是为获取早、中、晚G₁期细胞，这最好采用有丝分裂选择法或N₂O中期阻断法。因为此法对细胞正常生理干扰较小，细胞可比较正常地进入G₁期。