细胞分离技术
细胞分离技术即从血液或免疫器官中提取所需细胞的技术。分离血液细胞的最先进的方法是使用激发荧光细胞分离器。这种仪器可以从体内循环血液中直接分离、收集所需要的不同种的细胞,如白细胞、淋巴细胞和血小板等(参见“激发荧光细胞分类技术”)。
但在目前最常用的是淋巴细胞分离技术。手工分离淋巴细胞的方法很多,其原理是利用各种细胞在理化性质、表面标志和细胞功能等方面的差别而将不同的细胞分开。
以血细胞为例,各种细胞的比重不同,红细胞为1.093,白细胞为1.080~1.092,淋巴细胞为1.070。各种细胞的聚集倾向性也有差别。根据这些特性设计出的常用的分离技术有自然沉降法和梯度离心法。
自然沉降法是将含抗凝剂的全血置于垂直的试管中,细胞自然下沉,红细胞比重大、沉降快,首先下沉,淋巴细胞和部分白细胞留在上清部分。当出现红细胞与血浆的界面时,收集血浆层底部的细胞,其中含有丰富的淋巴细胞。若在抗凝的全血中加入某种试剂,促进红细胞聚集,则可加速红细胞下沉。常用的分离试剂有6%右旋糖苷、3%明胶及1%甲基纤维素等。
梯度离心法中应用最广的是Boyum 1968年创用的聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度分离法。分离液的比重(1.077)小于红细胞和白细胞,大于淋巴细胞,分离液的粘度适于红细胞和白细胞聚集。将血液置于分离液的液面之上,用适当速度离心,淋巴细胞和单核细胞沉积于分离液与血浆的界面上,其中淋巴细胞占80%以上;其他细胞沉于管底。此法缺点是在提取的细胞悬液中,混有单核细胞和极少量的红细胞。由于单核细胞具有吞噬功能,在分离的细胞悬液中或者分离前在血液中加入羰基铁粉,单核细胞吞噬了铁粉之后,可以用磁铁除去。此外也可以用吸附法除去单核细胞。
红细胞的脆性较大。在混有红细胞的淋巴细胞浓悬液中加入少量蒸馏水或低渗的0.83%NH4Cl-Tris缓冲液,均可使红细胞溶解,随后使悬液恢复等渗,即可得到较纯的淋巴细胞。
分离T细胞和B细胞的方法,目前正在研究,尚无理想的方法。目前使用的是E玫瑰花结细胞分离技术和EAC玫瑰花结细胞分离技术。将E玫瑰花结细胞悬液经梯度离心,B细胞浮于分离液表面,而T细胞随红细胞沉于管底。取管底的细胞经低渗处理除去红细胞,即得到较纯的T细胞。同理,用EAC玫瑰花结技术分离时,T细胞浮于分离液表面,而B细胞沉于管底。一般地说,提取T细胞时用EAC玫瑰花结技术,提取B细胞时用E玫瑰花结技术。这样所需要的细胞浮于分离液表面,搜集出来即可使用,不需经低渗除去红细胞,操作简便又可减少对所取白细胞的损失。