组织学标本制作技术

组织学标本分活体标本和固定标本。活体标本有新鲜的血滴、新鲜组织的涂片和印片及体外培养的活细胞和组织等。固定标本有经过化学固定剂固定的组织涂片、印片和展平的薄膜，还有经过固定，包埋在坚硬的介质中制成的薄切片。活体标本不经染色或经活体染色法染色，可在光学显微镜下进行短时间的观察，但这种标本不能长期保存。固定标本可用多种染色法染色，使光线易于穿透，能在光学显微镜下呈现易于辨认的图象。透射电子显微镜只能观察经固定和染色的超薄切片。目前应用最广的是光镜的固定和染色的切片。这样的标本可长期保存，称永久性标本。这类标本都须经过固定、制片、染色和封固等步骤。
固定 固定是用化学固定剂将组织和细胞迅速杀死并保存其生前的结构和化学成分。细胞的生前结构和化学成分经固定后总有不同程度的改变。一般溶解在细胞内的氨基酸、糖类在固定时都丧失，脂类易溶在有机溶剂中而失去。因而一般固定后的标本只能保存细胞生前蛋白质构成的大部分结构。固定剂分为醛类、醇类、酸类、重金属盐类和混合固定剂类，都是经验中摸索出来的配方，只对其中几种作用机制有所了解。
醛类 40%的甲醛的商品名叫做福尔马林，是最早使用的固定剂之一，应用最久最广泛。纯甲醛是从多聚甲醛解聚而配制的。甲醛单体在水中与氢原子结合成为羟甲基化合物而产生亚甲基桥，它可连接氨基、亚氨基、羧基等多种基团，因而能将蛋白质分子结合一起而保存细胞结构。戊二醛有两个醛基，与甲醛作用一样。单独使用的甲醛为4%水溶液，相当于10%福尔马林，也常和其它固定剂混合使用。戊二醛可单独或与甲醛混合使用，作为电镜标本制作的常规固定剂。
醇类 常用作固定剂的醇有甲醇和乙醇，均为蛋白质的凝固剂，都属强脱水剂。甲醇常用于血涂片的固定，乙醇渗入组织较慢，一般与其它固定剂混合使用。两者可单独在低温(-20°～-30℃)下用来固定冻结组织。经过醇类固定后，组织中脂类大部丢失。
酸类 酸类固定剂有醋酸、三氯醋酸、苦味酸等。酸类的特点是穿入组织快，一般不单独使用。经过含酸的固定剂固定后，核染色质和染色体的形态保存和染色较好。
重金属盐类 重金属盐固定剂有重铬酸钾、氯化汞（升汞）、四氧化锇（锇酸）等。这些重金属化合物都属强氧化剂，对于蛋白质都有凝固作用，对于类脂质也有亲合作用，特别是锇酸，对多数脂类氧化后本身还原成低价锇的黑色沉淀物，其它被氧化的化学物质也出现不同程度的沉淀物，因而同时又是“染色剂”。这三种重金属化合物有时单独使用，升汞穿入组织较快而重铬酸钾较慢，锇酸最慢。它们一般和其它固定剂混合使用。锇酸也用在电镜制片技术，作为醛类固定后的后固定剂。经重铬酸钾固定后组织易于染色，而经锇酸固定后则不易着色。
混合固定剂 常用的混合固定剂有Carnoy液是由乙醇、醋酸和三氯甲烷混合而成，因不含水，可迅速固定和脱水，对于核蛋白和糖原都能保存。Zenker液是由重铬酸钾和升汞混合而成，使用时加醋酸，为保存核结构并易于染色的常规固定剂； 加福尔马林后为保存细胞质结构并易于染色的固定剂，也称为Helly液。Bouin液是苦味酸、福尔马林、醋酸的混合液，固定迅速，是保存染色体的常规固定剂，但破坏脂质；最近将它应用于免疫组织化学，是保存抗原较好的固定剂。如以酒溶的苦味酸和福尔马林、醋酸混合一起，是保存多糖类的最佳固定液。Flemming液包含锇酸、铬酸、醋酸，是保存核和细胞质结构很完善的固定剂，早年研究染色体、线粒体等细胞结构时最常使用。
切片 切片技术是把组织切成薄片，以便光线透过，在显微镜下成象。为了加强组织的硬度，可用冰冻或各种包埋剂，使组织能切成所需的厚度。依包埋剂的不同，有冰冻切片，火棉胶切片，石蜡切片和电镜标本所用的超薄切片。
冰冻切片 组织须经骤冷，在一两分钟内完成。时间过长则组织中水逸出结成冰晶破坏组织。骤冷方法可利用液态CO₂扩散，固态CO₂或液氮直接降温，或借低冰点的烷类为介质，间接降温。骤冷的组织块可在冰冻切片机上切片。手术室快速检查一般用CO₂扩散的冰冻切片机在室温切片，能切成10～20μm的薄片供检查诊断。为研究用的标本则需使切片刀和组织块都保持较低的温度(-15°～-20℃)，才能切成1～3μm的切片。切片机保温在恒冷箱中进行切片称为恒冷箱切片法。恒冷箱利用制冷机使工作箱内保持稳定的低温。冰冻切片的组织可以是新鲜组织，骤冷切片后立即吹干，再进行固定； 一般是用先经过固定的组织。冰冻切片节省时间，组织不收缩，能保存组织大部分化学成分，特别是脂类和酶的活性等。
石蜡切片 常规制作的组织学标本是石蜡切片。石蜡硬度较大，可在切片机上切成厚数微米的切片，最适于组织学观察。组织块经过固定后，须经过脱水，透明，浸蜡等步骤才能将组织块包埋在石蜡中进行切片。脱水剂一般用梯度浓度的乙醇，由30%逐渐升级，使乙醇脱去组织内的水分。然后再用石蜡的溶剂，如二甲苯替换乙醇，最后使石蜡替换二甲苯，组织完全被石蜡浸透。常用56°～58℃熔点石蜡，因而浸蜡必须在保温箱中进行。浸透石蜡，冷却后则组织包埋在石蜡中。一般用1cm直径的组织块。乙醇，二甲苯都使组织收缩，在高温下浸蜡再度使组织收缩并破坏细胞多种酶的活性。尽管有这些缺点，但严格的常规操作所获得的组织学标本结构十分稳定，是观察组织和细胞形态学的标准方法。
火棉胶切片 火棉胶是纤维素一类的硝酸化合物。组织块固定后也是经过梯度浓度乙醇脱水至纯乙醇，然后经火棉胶溶剂乙醇乙醚混合液顺序进入4%和8%火棉胶溶液中。每级浸泡数天后或使溶剂挥发浓缩至16%，或换入16%火棉胶溶液内经更长时间浸泡。最后用70%乙醇或加少量纯氯仿（三氯甲烷）使之硬化，组织块即被包埋在火棉胶内。这种包埋法可避免高温，组织块收缩程度很小，优于石蜡包埋，但硬度稍差，只能切成7～15μm厚的切片，一些致密的组织和器官，如腱、软骨、骨、内耳、眼球等，用火棉胶切片能获得满意的标本。
超薄切片 电子显微镜的标本需要厚度不超过0.1μm的超薄切片。制备这种切片需用特殊的包埋剂和切片机。组织块包埋在合成的树脂内，可在超薄切片机上以玻璃刀或金钢石刀切成0.1μm以下的薄片。常规使用的包埋剂为环氧树脂。组织先经甲醛和戊二醛固定，再经锇酸固定，乙醇或氧化丙烯脱水，放入环氧树脂包埋剂内。环氧树脂在60℃需48小时聚合成坚硬的固体，将组织包埋其中。超薄切片机也不同于以螺旋推动的普通切片机，而是借电热使标本持器杆逐渐膨胀，标本随之向刀口推进。这种切片机都有自动控制的装置，所用的刀是由特质玻璃制成，比钢刀更为坚硬锋利，有时用金刚石制成的刀，比玻璃刀锋利耐用。切片经醋酸铀和柠檬酸铅染色，放在特制的铜网上在电子显微镜下观察。
染色 经各种方法制出的切片都是无色半透明的，经过染色可加强各种结构间的对比，在显微镜下易于分辨。常规苏木精和伊红(H.E)染色可将核染成蓝紫色，细胞质呈深浅不同的粉红色。苏木精是天然植物染料，借铵或铁的矾类作为媒染剂。苏木精染核的机制不明，但并非与核酸结合，因核酸经水解后苏木精染核的性质不变。除苏木精外，苯胺染料如天青、亚甲基蓝、甲绿、甲苯胺蓝等均为核染料，且都是与核酸结合的碱性染料。染胞质的染料还有桔黄G、苯胺蓝、苦味酸、藻红等，称为酸性染料。常规染血涂片的瑞氏(Wright)染剂，即是由亚甲基蓝与伊红中和沉淀而成。白细胞的颗粒为亚甲基蓝染色的为嗜碱性，为伊红染色的为嗜酸性，混合染色的为中性。碱性染料除染核外，还染软骨基质、某些粘液腺分泌物、肥大细胞颗粒等；酸性染料则染胶原纤维、肌组织、甲状腺滤泡胶体等。常规组织学染色还有Mallory三色染剂，是由酸性品红、苯胺蓝、桔黄G组成。细胞核被酸性品红染色，胶原纤维为苯胺蓝染色，红细胞为桔黄G染色。其它组织器官和特殊结构的显示，都有特殊的固定和染色方法。如不同的Golgi银浸染法，能显示高尔基器或神经元。中心粒，纺锤体，线粒体，细胞间质等都各有特殊显示方法。染色后的标本，一般经二甲苯透明、用树胶封固永久保存。
上述组织学染色方法是从经验摸索而获得的，它们染色的化学机理不甚了解或在推测中。根据化学方法在组织切片上进行反应，染色的结果可准确地显示组织和细胞细微结构的化学成分及其活性。这些方法属于组织化学的范畴。这方面的发展异常迅速广泛，包括许多物理化学技术(参见“组织化学”条)。