竞争放射分析法

竞争放射分析法也称饱和分析法，是一组超微量体外分析技术的总称。它们的工作原理都是利用某种特异结合试剂与被测物和标记物发生竞争结合反应，从而对极微量的物质作定量。这类方法灵敏度、精密度、特异性都较高，操作较简便，医学上应用很广。
工作原理 按一定次序向每一反应管加入以下各物：
❶被测物和不同量的结构相同的标准品(°P);
❷固定量的标记物(^*P)，其结构与被测物相同或相似；
❸与被测物及标记物有高亲和力的特异结合试剂(q)，固定其用量使之在°^P＝0时只能与部分^*P结合。
q与°P及^*P的结合是可逆反应，由于q有限，°P与*P就要竞争其结合部位。若严格控制各管的反应条件(温度、pH、离子强度、体积等)相同，则反应达到平衡后，结合物中的放射性随°P的量而变，°P越多，^*P结合越少，结合物放射性越低（见图）。以标准品制得标准曲线，即可根据未知样品结合部分的放射性求出其中被测物的量。

饱和分析法原理示意
F%: 游离部分放射性百分比
B%: 结合部分放射性百分比

实践结果及数学推导都表明，若以°P为自变量（横坐标），结合部分的放射性(E)或游离部分的放射性(F)或二者的比例(B/F)为应变量（纵坐标）作图，都是曲线。提出过许多变换坐标以得到直线的办法，其中较常用者见图1。直线化可减小目测法作图的误差，并使数据处理便于计算机化，但并不提高测量的灵敏度及精密度。

图1 几种常用标准曲线的形状
B和F均以所加放射性的百分比表示 °P为标准品
的量 ^*P为标记物的量B₀为无P时的B

标准曲线斜率越高，同样量的放射性变化反映的°P的变化越小，所以在其他误差因素相同时，斜率越高，测量的精密度及灵敏度越高。但斜率越高，标准曲线可使用的范围往往越窄，故斜率选择在什么范围应视样品中被测物的含量而定。
特异结合试剂 竞争放射分析法中应用的特异结合试剂有：抗体、受体、血浆中的激素结合蛋白、酶、微生物等。根据所用特异结合试剂的种类，各类方法有不同的名称：放射免疫分析法、放射受体分析法、竞争性蛋白结合分析法、放射酶分析法、放射微生物分析法等。由于绝大多数特异结合试剂都是蛋白质，竞争性蛋白结合分析法有时也被广义地用于泛指各种竞争放射分析法。
对特异结合试剂的主要要求是平衡常数 （也称亲和常数）K要大。实验和计算表明，K越大，标准曲线的斜率越高。一般说，放射免疫分析法的K值大于或接近放射受体分析法，后者的K值又大于竞争性蛋白结合分析法(见“放射免疫分析”、“放射受体分析法和受体的放射分析”条)。K值通常通过实验求出，方法有好几种，最常用者为Scatchard作图法。其所依据的公式是，当反应达到平衡时，结合部分和游离部分的浓度比为结合物浓度的一次函数：

式中[q]为最初加入的特异结合试剂浓度。故若以B/F为纵坐标，〔结合物〕为横坐标作图，应得一直线，该直线延长至横坐标的交叉点即为[q]，而斜率即等于一K。

图2 Scatchard作图法
示意
结合物浓度由每一反应管
所加被测物（包括标记物）
的总浓度与结合百分率的
乘积算出

对特异结合试剂的第二个要求是特异性要高。特异性不高则须预先除去样品中可能引起交叉反应的物质，既增加操作步骤，还可引入额外误差。放射受体分析法特异性较高，抗体的特异性则随批号而不同，需仔细挑选。特异结合试剂的用量对标准曲线斜率有较大影响。实验及计算表明，当^*P的化学量接近零时，特异结合试剂的用量选在B₀ (无^*P时的结合%)为33%时标准曲线起始段的斜率最高，亦即灵敏度最高。当标记物化学量较大，接近4/K时，选B0为50%的用量起始段斜率最高。实际使用浓度常在33%至50%间挑选。有时也选更高的浓度，此时起始段斜率降低但使用范围可较宽。
标记物 标记物的化学量越少，非标记物越容易与之竞争，测量的灵敏度也越高。故竞争放射分析法需要用高比放射性的标记物，通常都是用³H或¹³⁵I标记物。多肽及蛋白质大多用¹²⁵I标记，标记条件应尽量温和，每一分子上不宜接太多¹²⁵I原子，以免影响标记物与特异结合试剂的结合特性。小分子物质常用化学法制备高比放射性的³H标记物，若需要更高的比放射性，也可先连接酪氨酸甲酯再用¹²⁵I标记。标记物的结构不一定要求与被测物完全相同，但两者在特异结合试剂上必须有相同的结合部位，互相能起竞争作用。标记物的放射化学纯度越高越好，但多数情况下放射化学杂质并不参予结合反应，若最后是测定结合部分的放射性，标记物的放射化学纯度降至90～95%对实验结果的影响常不很大。
>标准品 标准品是定量的依据，应与被测物结构完全相同，纯度要高，含量要准。若所用标准品的标定含量与真实含量有差距，则测定值出现系统误差，严重影响准确度。若各次实验标准品含量不一致，则组间变异增大，使前后数据无法互相比较。所以保证标准品用量的准确十分重要，使用者特别需要注意标准品的保存。
结合反应的温度与时间 大多数结合反应的K值随温度降低而增大，至4 ℃左右最大，少数反应(如地高辛、睾丸酮的放射免疫分析法)温度升高K值下降不明显甚至反而升高。不同反应达到平衡的时间从数小时至数天不等，温度越低达到平衡所需的时间越长。故反应的温度及时间应具体制订。在少数场合，为了尽快获得测量结果，可缩短反应时间，不待达到平衡即终止反应。反应温度应保持到结合部分和游离部分分开为止。
结合和游离部分的分离 对分离方法最主要的要求是分离应尽可能完全，并有良好的重复性。亦即无特异结合试剂时放射性应接近100%在游离部分中，而有过量特异结合试剂时，结合部分的放射性不应在游离部分中出现。实际分离方法上述两指标均非100%，只能在相互比较中加以挑选。
对分离方法的另一个重要要求是不能干扰反应结束时的平衡状态。故整个分离过程应保持反应时的温度； 对用吸附剂除去游离部分，使结合部分保留在上清液中的方法，还需严格控制分离操作的时间，以防结合部分解离。
常用的分离方法有： 用吸附剂除去游离部分，如加膜活性炭、某些离子交换树脂等；用沉淀剂收集结合部分，如硫酸镁、聚乙二醇等； 用第二抗体沉淀抗原抗体复合物； 用微孔薄膜吸附结合部分； 用聚乙烯等材料吸附抗体，抗原抗体结合反应在固相上进行，即所谓固相放射免疫分析法。各种方法各有优缺点，对不同反应系统的分离效果也不同，通常根据具体实验条件进行选择。
被测样品的预处理 样品预处理的目的： 除去有交叉反应的物质及可能干扰结合反应的其他杂质如蛋白质及过多的盐分等； 有时被测物含量太少可加以浓缩。预处理的方法很多，从简单的稀释、浓缩、溶剂提取，到沉淀蛋白、电泳、层析等。对象不同及反应系统不同，样品处理的要求也不同。另一方面，样品处理过程又可给测量带来新的干扰。首先纯化过程可造成部分被测物的破坏或丢失，有时需作回收校正。其次，容器、试剂甚至蒸馏水可带入化学杂质，改变pH，甚至带入霉菌，故样品处理的每一步都需严格要求，订出能排除干扰的操作规程。
方法考核及质量监督 对任何一种竞争放射分析法的基本要求是能够对样品中的被测物给出可靠的数据，误差尽可能小，能反映病人或实验对象的真实变化情况。为此，在建立一个方法时必须进行方法考核，在使用过程中还需进行质量监督，以确保方法的可靠。方法考核及质量监督主要包括以下几方面：
(1) 精密度： 即复管间的变异系数。变异系数越小，说明同一样品重复测定的数据越接近，故所能觉察到的病理或药理变化越小。对一批双复管的样品，变异系数可计算如下：

式中N是双复管的对数，d是各对复管的差值，M是总均值。每一具体方法的变异系数随样品含量不同而异，通常是标准曲线的两端变异系数大，中间一段小，一般要求C.V.≤±10%。所以最好对不同含量的样品分别求C. V.，以含量为横坐标，C. V.为纵坐标，作出精密度分布图。较好的方法有时标准曲线中间部分的C.V.可<±5%。
(2) 灵敏度： 即探测极限或最小可测到的量。通常以一批零标准管实测值的95%可信限来衡量。标准曲线的起始段C.V.较大，故建立方法时应要求被测样品的含量不可过于接近探测极限，尽可能避免使用标准曲线的起始段。
(3) 准确性： 即测量值与真值接近的程度。准确性除受标准品的影响外，也受精密度或其他干扰因素的影响。通常以样品中外加标准品的平均回收率是否接近100%作为准确性的主要判据。此外，也常以不同量样品的测定值是否呈线性作为考核手段。后者还有助于确定实验中样品量的范围。
(4) 重复性： 即组间变异。通常以同一来源的样品在不同次实验中所得数据按一般统计学方法求变异系数，一般要求≤±10%。为了确保临床样品不同日期测定结果的可比性，有时还可用妥善保存的同一来源的血样品作为“参考样品”，对重复性进行“监视”。
对新建立的方法，除以上几个主要判据外，测定其K值和特异性（交叉反应）等也是必要的。也有人主张，用电子计算机处理每次实验数据时可采用Scatchard作图法作为质量监督的指标。
近年来，竞争放射分析法的医学应用已十分普及，测定结果是否可靠已直接关系到病人的诊断和治疗。各实验室的测定结果能否互相验证还涉及一些重要医学研究课题（如计划生育等）能否得到正确的结论。因此，一些国家已开始进行实验室间的质量监督。由负责质量监督的部门定期向许多实验室分发同一来源的样品，定期收回测定结果，进行统计分析，从中可以看出某一分析项目是否存在普遍性问题，同时也可看出每一实验室的分析工作是否可靠，以及不同厂商的试剂盒有无差异。这种分析对各实验室提高工作质量很有裨益。