盐析法

生物大分子之间，特别是酶和杂蛋白，在作不同结构的蛋白质的分离时，常可通过在含有这些溶质的溶液中加入不同浓度的中性盐，使不同性质的蛋白质分别从溶液中沉淀出来，这种过程称为“盐析”。单纯使用盐析方法虽还不能完全分离及提纯蛋白质，但是由于方法简便，设备简单，又适于大量样品的制备，而且与其它方法结合起来，可使蛋白质纯化的倍数进一步提高。因此至今仍为分离、纯化蛋白质或酶的最常采用的方法之一。
盐析法的基本原理 蛋白质、酶在低浓度的盐浓度中，可观察到它们的溶解度随着盐液浓度的升高而增加。但当盐浓度不断上升时，各种蛋白质和酶的溶解度又以不同程度降低并且先后析出。这一现象的基本原理在于蛋白质分子及分子间带电荷的极性基团在溶液中存在少量盐类时，相互之间的静电引力受到影响，因此蛋白质在水溶液中溶解度增大、但是盐浓度继续增加到一定程度时，水的活化度被降低，蛋白质表面的电荷被中和，分子表面的水化膜被破坏，于是蛋白质分子相互聚集而沉淀析出。在一定浓度的盐溶液中，结构不同的蛋白质或酶，它们溶解度降低的程度亦不同，因此可用加入中性盐的方法使它们彼此分离。
蛋白质或酶的溶解度与中性盐的离子强度有关，可用下式表示：
式中S₀为电解质（中性盐）在纯水 (I=0) 中的溶解度，S为非电解质（蛋白质）在某一离子强度等于I的溶液中的溶解度，KS为盐析常数，中性盐的离子强度I可用下式计算：
m为溶液中各种离子的克分子浓度，z为各种离子的价数。
在一定温度下，S0对某一蛋白质及某一溶剂来说为一常数，所以前式可改写为：

logS=β-KSI

式中β=log S0也为一常数，β值主要取决于蛋白质性质，其次与溶液的pH和温度有关。KS值主要和溶质的结构及性质有关，与中性盐的z值和平均半径有关，也与溶剂的电解常数有关。
中性盐的选择 蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。其中应用得最广的是硫酸铵，它的优点是溶解度大，饱和溶液所含的硫酸铵浓度可达很高，而且在水中的溶解度受温度的影响很小，它一般不会引起蛋白质的变性，甚至高浓度硫酸铵还有稳定某些酶的作用； 缺点是对蛋白氮的测定有干扰，硫酸铵浓溶液的pH常在4 5～5.5之间，当用其它pH值进行盐析时，需用硫酸或氨水调节。硫酸钠作为中性盐沉淀剂的优点是不含氮，因而不影响蛋白氮的测定，如盐析免疫球蛋白，用硫酸钠的效果不错，缺点是30℃以下它的溶解度太低，因此操作时常要控制在30℃以上。
硫酸铵饱和度计算方法 硫酸铵浓度习惯上用饱和度的百分数来表示。从一定饱和度要达到另一饱和度，每100ml溶液中需要加入多少克固体硫酸铵可以查表得到。也可按下式计算：
式中x为将1升饱和度为C₁的溶液提高到饱和度为C2时所需硫酸铵的重量（克）,G与A均为常数，与温度有关，G在0℃时为707,20℃时为756,A在0℃时为0.27,20℃时为0.29。但是，在盐析过程中，常应用的不是固体硫酸铵，而是用饱和硫酸铵或高饱和度的硫酸铵溶液。这时，从一个饱和度要达到另一个饱和度需要加入饱和硫酸铵溶液的量，可据下式计算：
式中V及V₀分别代表所需加入饱和度硫酸铵溶液及原溶液的体积，C2及C₁分别表示所需达到的和原溶液的饱和度。
用硫酸铵沉淀比较温和的方法是逐滴加入饱和硫酸铵溶液，但加入饱和硫酸铵溶液会使溶液体积增加太快。因此，如所需达到较高饱和度而溶液体积增加太快。因此，如所需达到较高饱和度而溶液体积又不能过分增大时，可采用直接加入固体硫酸铵的方法。
盐析时应注意的因素
(1) 盐的饱和度： 是影响蛋白质盐析最主要的因素。不同蛋白质的盐析要求盐的饱和度不同。分离几种蛋白质的混合组分时，盐的饱和度常由稀到浓逐渐增加，每出现一种蛋白质沉淀进行离心或过滤分离后，再继续增加盐的饱和度，使另一种蛋白质沉淀。例如用硫酸铵盐析分离血浆中的蛋白质，饱和度达20%时，纤维蛋白原首先析出； 饱和度增至28～33%时，优球蛋白析出，饱和度再增加至33～50%，拟球蛋白析出； 饱和度大于50%以上时，清蛋白析出。这就是用硫酸铵不同饱和度的分段盐析法。
(2) pH值： 盐析沉淀蛋白质时，溶液的pH值也很重要。一般来说，蛋白质都是在接近等电点时最易被盐析出，只有个别例外，如触珠蛋白在偏酸或偏碱的pH时才易被盐析出。因此，盐析时，pH值常选择在被分离的蛋白质等电点附近。
(3) 蛋白质浓度： 在盐析蛋白质时，溶液中蛋白质的浓度对它本身的沉淀有双重影响，它既影响所需中性盐饱和度的最低极限，又影响其它蛋白质与欲分离蛋白质的共沉作用。如沉淀血清球蛋白时，如果将血清球蛋白浓度自0.5%递增至3.0%，则所需中性盐饱和度的最低极限从29%递减至24%。也就是，蛋白质浓度越高所需盐的饱和度极限愈低。但是蛋白质越浓时，其它蛋白质的共沉作用也越增加，所以当溶液中蛋白质太浓时就应进行适当稀释(稀释至2.5～3.0%之间)，尽可能避免共沉作用的干扰。
(4) 温度： 由于浓盐溶液对蛋白质有一定的保护作用，所以一般可以在室温下进行盐析。但当盐析某些对温度敏感的蛋白质或酶时，则最好在4℃左右进行。某些蛋白质，如血红蛋白、肌红蛋白、血清蛋白等在常温(例如25℃)较在0℃时更易被中性盐沉出。有些蛋白质如触珠蛋白、前清蛋白等在浓盐存在下比在较高温度下更易形成结晶，但另一些蛋白如人血清清蛋白则必须在低温下长时间放置才能形成结晶。可见在中性盐下结晶纯化时，温度影响则比较明显。
盐析后去盐及浓缩
(1) 去盐： 最常用的去盐法是使用透析袋透析。透析袋事先需用水充分洗涤以除去增塑剂。装入待透析的蛋白质溶液后两端应折叠扎紧。透析开始时可用流动的蒸馏水，大部分盐被透析出后，再改为生理盐水、缓冲液。透析需在较低温度下进行。也可以采用电透析法，开始时，由于盐浓，要低电压，随着透析袋中盐浓度降低（注意经常更换透析外液），应逐渐升高电压，直至将盐完全透析出为止。但电透析易产热，需注意适当冷却。用葡聚糖凝胶 (G-25) 去盐效果很好，一般所需凝胶体积是脱盐样品量的10倍左右。柱的高度与直径比例以5:1～15:1为宜。用水或缓冲液平衡柱后即可上样品，继续用水或缓冲液洗脱，洗脱出第一峰为蛋白质。此法去盐较透析法快速。
(2) 浓缩： 浓缩蛋白质最好用冷冻干燥法，可用冷冻干燥机，也可安装简单的装置，只需一个较大容量的真空泵及干燥器、干冰、五氧化二磷等即可。如无设备也可用透析袋进行浓缩，将待浓缩之蛋白放入细透析袋中，置入搪瓷盘内，透析袋外撒上聚乙二醇6000或聚乙烯吡咯酮、或蔗糖，利用它们的吸水性来浓缩样品。也可用电风扇吹干悬挂在透析袋中的溶液来达到浓缩目的。最近有各种超滤膜和超滤器供应，连接水泵抽气或高压氮气，用超滤的方法浓缩更为简便。