病毒检测

病毒检测是指为了诊断病毒感染而采取检查受感染组织细胞中的病毒或病毒抗原的方法。常用的方法有如下几种：
电子显微镜法 用电子显微镜观察病毒形态以进行诊断的方法，优点是可以进行快速紧急诊断，还可观察难以分离培养的病毒。缺点是需要有电子显微镜设备，有时还需要有超速离心设备。用电子显微镜检查单纯疱疹病毒脑炎病例的脑组织，可以根据包涵体内单纯疱疹病毒颗粒的形态作出诊断。有一些难以分离培养的病毒，例如引起婴儿胃肠炎的轮状病毒、Norwalk因子和腺病毒以及引起甲型肝炎和乙型肝炎的病毒，可以用电子显微镜和免疫电子显微镜技术观察病毒颗粒的特征和抗原抗体作用，作为一种诊断的方法。还可以用电子显微镜技术快速诊断天花病毒、副流感病毒、腮腺炎病毒、呼吸道合胞病毒、巨细胞病毒、水痘-带状疱疹病毒和乳多泡病毒感染。
免疫荧光法 其原理是将免疫球蛋白同荧光素用生物化学方法结合而不损害免疫球蛋白的生物学性质或免疫性。将荧光素标记的免疫球蛋白同组织或细胞内的特异性抗原在合适条件下结合，用荧光显微镜可以观察到抗原存在的部位出现荧光。这种方法可以用来检测抗原的存在。免疫荧光技术主要有直接法和间接法两种。直接法是将抗病毒的IgG抗体直接标记荧光素，通常用异硫氰酸荧光黄，检测病毒抗原。间接法是用标记了异硫氰酸荧光黄的抗IgG的抗体，检测抗病毒的抗体同病毒抗原的结合物。直接法比较简单，特异性较高，灵敏性稍低，只适用于相应的病原的检测。间接法稍为复杂，但可以只用一个标记荧光素的抗IgG的抗体检测多种病原。灵敏性较高，比直接法约高10倍，特异性稍低。免疫荧光法可以用于检测病人患病器官的脱落细胞或活组织细胞内的病毒抗原，也适用于检测尸检组织细胞内的病毒抗原。特异的荧光出现在细胞内，其分布部位取决于病毒种类。DNA病毒一般在细胞核内增殖，所以细胞核发荧光。RNA病毒一般在细胞质内增殖，所以细胞质发荧光。重要的是，所观察的细胞类型应该是病毒所侵入增殖的患病器官的细胞类型。只有在这种类型的细胞内所发的荧光才被认为是特异的。需要用正常血清进行平行对照。免疫荧光诊断应用的成功与否只有同通常用的标准方法仔细比较后才能作出评价。其优点是可以快速检测难以培养的病毒，可以检测大量标本，用于流行病学调查，可以定性和定位，可以减轻病毒分离培养工作和简化病毒鉴定步骤，比病毒分离法灵敏，也比电子显微镜法稍为灵敏。放射免疫荧光法的应用范围更广，可以定性、定位和定量。其缺点是纯化抗原较复杂，非特异性荧光可以影响结果，需要有荧光显微镜设备。
免疫荧光法已被应用于许多种病毒抗原的检测，包括甲型和乙型流感病毒，副流感病毒1～4型，呼吸道合胞病毒，腺病毒，麻疹病毒，风疹病毒，腮腺炎病毒，单纯疱疹病毒，水痘-带状疱疹病毒，巨细胞病毒，EB病毒，痘病毒，披膜病毒科甲病毒属和黄病毒属病毒，Lassa病毒，狂犬病病毒，淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒，Mengo病毒，脊髓灰质炎病毒，柯萨奇病毒，ECHO病毒，呼肠孤病毒，轮状病毒，星状病毒，乙型肝炎病毒表面抗原和核心抗原，口蹄疫病毒，水泡性口腔炎病毒，以及与流行性出血热相关的病毒抗原。
免疫酶法 这是根据免疫荧光法的原理发展起来的，可以用直接法或间接法。应用这个方法的原理是将一种酶同抗病毒的IgG结合（直接法），或同抗IgG的抗体结合（间接法）。有很多种酶可以使用，最常用的是辣根过氧化物酶。这种酶比其他酶具有以下优点：
❶其细胞化学染色在光学显微镜和电子显微镜下都易于观察，并可得到满意的和能重复的结果；
❷大多数已经发展的连接方法都是使用过氧化物酶作标记的；
❸过氧化物酶很少有游离氨基酸基团，可适用于两步连接法；
❹过氧化物酶的分子量小(40,000道尔顿)，其结合物较易透入已固定细胞的内部；
❺过氧化物酶耐受各种组织化学的处理。在受感染的细胞内酶的存在能使被酶作用物（底物）3,3′二氨基联苯胺四氯化物(3,3′-diaminobenzidine tetrachloride)在有过氧化氢的条件下发生氧化，产生永久性棕色来测定。可以用免疫反应或化学反应将IgG同过氧化物酶结合。用化学连接法比较简便，可以得到很好的结果。化学连接法主要有两种：一种是用戊二醛，是一种薄组织切片固定剂，最常使用；另一种是用过碘酸盐，可以用过碘酸钠。过氧化物酶标记的抗体能在低温下保存几个月。
这种方法的优点是：可以用光学显微镜或电子显微镜观察；染色标本可以长期保存；较简便特异；灵敏度高，同放射免疫法相等；快速；结果同用免疫荧光法的一致；可以检测大量标本，适于现场应用。其缺点是：纯化抗体和结合酶较复杂，内源性过氧化物酶可以影响结果；抗原含量少时，不如免疫荧光法明显及易于观察。它已经被成功地用于检测组织培养中的单纯疱疹病毒、EB病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、乳腺瘤病毒、脊髓灰质炎病毒、节肢动物传播的病毒和巨细胞病毒的抗原。它还被用于检测蚊唾液腺中的加里福尼亚脑炎病毒抗原。目前，应用于检测临床材料中病毒抗原的资料还少。临床材料含有内源性过氧化酶，可能对检测有影响，可以用化学方法去除其活性。这已经被成功地用于单纯疱疹病毒1型和2型以及狂犬病病毒抗原的检测。
酶联免疫吸附检测法(ELISA) 这是一种固相免疫酶法。其原理同用免疫过氧化物酶法检测抗原相似，但需要使用一种表面具有吸附能力的物体，例如用聚苯乙烯管或珠。常用的方法是双重抗体夹心法。将特异性抗体吸附在聚苯乙烯管或珠上，然后加含有未知抗原的临床标本提取物，再加同碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶连接的特异性抗体，最后加底物。颜色的改变用肉眼观察或用分光光度计测定。还可以用竞争法，将特异性抗体吸附在聚苯乙烯管或珠上，然后加未知抗原同标记了酶的已知抗原的混合物，或先加未知抗原，过一短时间后再加标记了酶的已知抗原。最后加底物。所产生的颜色强度同只加标记了酶的已知抗原所产生的颜色强度进行比较。如果减弱，则表示被未知抗原竞争，两种抗原相同。颜色强度的差别表示未知抗原的量。也可以用间接法。
这种方法的优点是：简便；可以用简单的比色计或肉眼观察；灵敏度与放射免疫法相等，结果同用电子显微镜法一致，适于现场应用。缺点是处理聚苯乙烯管或珠、纯化抗体和结合酶较复杂。此法已被应用于乙型肝炎病毒表面抗原、单纯疱疹病毒1型、轮状病毒和病毒的抗原的检测。
反向间接红细胞凝集法 又称反向被动红细胞凝集法。这是用鞣酸或其他连接剂将纯化的抗体结合在用醛类化合物处理过的新鲜红细胞表面，用以检测抗原，使结合在红细胞上的抗体同抗原产生特异性反应，引起红细胞凝集。这种方法的优点是简便、快速、灵敏和特异，比对流免疫电泳法灵敏。缺点是特异性不如放射免疫法和酶联免疫吸附检测法。已用于腺病毒、巨细胞病毒和乙型肝炎病毒表面抗原的检测。
对流免疫电泳法 溶液中的带电质点，在电场作用下，向着带相反电荷的电极移动。在特定pH值的电解质中抗原带阴电荷，抗体带阳电荷，二者相对移动，相遇后形成复合物，产生肉眼可见的沉淀线。这种方法的优点是简便、灵敏、快速、节约，比电子显微镜法和琼脂弥散法灵敏，可检测大量标本。缺点是不如补体结合法灵敏。此法已用于乙型肝炎病毒表面抗原和轮状病毒抗原的检测。放射免疫检测法 将抗体标记放射性同位素，同病毒抗原结合，计算结合的放射活性。这种方法简便、快速、特异、最灵敏，使用试剂量小，可检测大量标本。缺点是需要放射性同位素实验设备。此法已用于检测乙型肝炎病毒表面抗原，西部马脑炎病毒、登革病毒和轮状病毒的抗原。
免疫红细胞粘连法 抗原同抗体结合后，在有活化的C3补体存在的情况下，使人的O型红细胞发生粘连凝集反应。这种方法快速、灵敏，同反向间接红细胞凝集法的灵敏度相当，其缺点是受参与反应的因素的影响。此法已用于检测乙型肝炎病毒表面抗原和轮状病毒抗原。
补体结合法 病毒抗原同特异性抗体形成复合物时能结合补体。加定量补体到抗原-抗体反应系统中，补体被结合，形成病毒抗原和相应抗体结合补体的复合物。此时加入绵羊红细胞-溶血素的反应系统，则后者因缺少游离的补体参与其反应，所以不发生溶血，结果为阳性。如果病毒抗原没有同特异性抗体形成复合物，则补体仍以游离的形式存在。加入绵羊红细胞-溶血素的反应系统时，补体能参与其反应，而发生溶血，结果为阴性。可以使用这种方法检测相应的病毒抗原。优点是特异、灵敏，比对流免疫电泳法灵敏，可检测大量标本。缺点是影响的因素较多，操作比较繁琐。此法已用于检测乙型肝炎病毒表面抗原和轮状病毒抗原。
双向琼脂弥散法 病毒抗原同相应抗体进行琼脂弥散时，形成吻合的沉淀线。如果抗原性有部分不同时，沉淀线就不完全吻合。这种方法操作简单，节省抗体，特异性高，适于大量标本检测。缺点是灵敏度较低。此法已用于乙型肝炎病毒表面抗原的检测。
分子杂交法 用病毒特异的互补DNA探测细胞中的病毒DNA或RNA。将认为含有病毒或病毒DNA的细胞或组织置于盖玻片上固定，加氢氧化钠处理，然后加用同位素标记的病毒特异的互补DNA作为探针。如果有可检测出的互补排列顺序的病毒DNA存在，则互补DNA同细胞内的细胞DNA产生杂交。在洗涤去除非特异结合的互补DNA后，进行放射自显影。不仅能显示病毒DNA的存在，而且能定出它同细胞结构的关系。这种方法的优点是比较快速、简便和可靠。它能检出病毒基因组，不论有无感染性的病毒存在。不论是缺损包膜的病毒或只是病毒DNA的片段，都能产生杂交。事实上，不能用任何其他方法检测的病毒，都能用这种方法检测出来。不需要用组织培养，所以不会传失。其缺点是需要用病毒特异的互补DNA作为探针，制备较复杂。此法已用于EB病毒、巨细胞病毒和单纯疱疹病毒的检测。对检测疱疹病毒组特别有用。