电压固定实验

根据Hodgkin等提出的理论，动作电位的产生和复极，关键在于膜对不同离子通透性的改变。Hodgkin等(1949)用著名的电压固定实验，对膜的离子通透性进行直接测量，确定出它们变化的幅度和时间经过。通过这类实验，他们对Na+、K+等离子的通透性随膜电位水平和时间因素变化的情况，即所谓离子通透性的电压依从性和时间依从性的问题，作了定量的、动态的描述，为近代兴奋膜生理学奠定了坚实的基础。这个方法至今仍然是研究兴奋膜特性和与之有关的离子动力学基础的基本方法之一。
从动作电位引起过程的实验中知道，膜的兴奋与膜的去极化有关，这提示通透性的改变可能是由于静息膜电位数值的变小引起的。为了观察膜电位水平和通透性之间的依从关系，理论上可以通过一个外接电源人工地使膜电位改变到某一数值，维持几个毫秒的时间，同时测定这段时间内通过膜的离子电流的变化，由此再推算出膜通透性改变的情况。因为所谓通透性的大小，一般可理解为某一物质通过膜的难易程度； 如果所涉及的物质是带电的离子，那么膜对它的通透性就可根据通过膜的离子电流的大小来度量，但要求的条件是这时膜电位必须保持固定。这就是说，如果在实验中能保持膜电位固定不变，膜电流的变化就只反映膜电阻或它的倒数膜电导（单位为姆欧）的变化，而后者实际上就相当于膜通透性的变化。但是在实际实验中遇到的困难是，膜电流变化本身会引起膜电位的改变 （自然情况下的动作电位正是这样产生的），这就会使原初给定的膜电位发生变动，破坏了实验要求的条件。为此，Hodgkin等设计了一个用负反馈原理构成的电子学线路来解决这一问题。图1是用巨大轴突进行电压固定实验的模式图，其中金属丝电极E′插入轴突内一段距离，用来测量这一段膜的膜电位数值，此电极连于一个高阻抗跟随器(XI)，后者的输出记录于E，同时输给一个负反馈放大器(FBA)，将所测得的膜电位与实验中要求固定的膜电位不断进行比较，如果前者偏离了后者，则根据二者的误差信号，立即由放大器输出一定量的电流，经插入轴突的另一电极I′通向膜内，此电流的大小和方向刚好能抵消引起膜电位波动的膜电流，保持膜电位固定于规定的数值不变。整个过程都由电子学回路精确地自动地完成，不论膜电流怎样变化，E上总保持固定的电压值，而这时所看到的变化只是通过电极I′和膜外另一接地的电极之间的电流变化，记录于I上，它虽然表示了用来抵消膜的离子电流的外加电流的变化情况，却正是我们要测定的膜电流变化的镜像，电压固定实验的数据就是由此取得的。

图1 在枪乌鲗巨大神经轴突进行电压固定实验的模式图

不难看出，电压固定实验的意图就是在膜电位突然跃变并固定于某一数值时，观察膜电流的改变，由此再算出膜电导即膜通透性的改变。因为膜有电容的性质，当外加电源以一个不同于原静息电位数值的电压作用于膜时，由于膜被充电或放电，膜上将出现一个短暂的电容电流，但这个电流一般只维持数个微秒，因而我们在整个电压固定期间所看到的膜电流的改变，主要是由离子通过膜所造成的离子电流的改变。Hodgkin等在实验中观察到，如果把巨大轴突的膜电位由静息时的-65mV突然固定到-130mV的水平，这时并不引起离子电流的改变；但如果将膜电位向去极化的方向改变，例如将膜电位固定到零电位附近的水平，则将引起膜电流的明显改变。图2A是将膜电位固定于-9mV时出现的离子电流的变化情况，即首先出现一个持续1～2ms的内向电流，它以后又被一个明显的外向电流所代替。这个结果正是“钠假说”所预期的。他们又用以下一些实验证明了内向电流是由Na⁺内流所造成：
❶用氯化胆碱代替海水中的NaCl时，内向电流不再出现，整个离子电流曲线由A变为B，将两条曲线作代数相减，可得曲线C，它应代表钠电流INa的变化情况，曲线B则应是造成膜复极的外向的钾电流IK;
❷如将膜电位固定于与Na⁺平衡电位相同的水平，内向电流也不出现，因为理论上这时即便有钠通透性的增大，膜内的正电位也正好能阻止Na⁺的净内流，故INa应为零，而这就从反面证明了内向电流是Na+的内流造成的。此外，利用示踪性同位素和轴浆灌流等实验，也证明了上述外向电流主要是由K⁺的外流造成的 。六十年代后期发现某些药物可以选择性地阻断膜对某些离子的通透性，如河豚毒、贝介毒(Saxitoxin)可阻断Na⁺的通透性，四乙铵和其他季铵类离子可阻断K⁺的通透性，这些发现一方面为分离不同的离子电流提供了方便的手段，一方面也提示这些离子的通透性可能是由相互独立的专用膜通道来决定的。

图2 电压固定实验时的膜离子电流的变化

将枪乌鲗巨大轴突的静息电位突然由-65mV固定到-9mV的水平时(上方E曲线表示)，膜的离子电流的变化情况(中间曲线A)。B、C曲线的意义见正文。曲线在点线下方为膜内向电流，在点线上方为外向电流

根据电压固定实验中得到的IN_a和IK的变化情况，就可以由下式分别算出钠电导(gN^a)和钾电导(g^K)的变化情况：
g^Na＝IN_a/(E-EN_a) (1)g^K＝IK/(E-EK) (2)
式中E是实验中保持固定的电压值，EN和EK分别为Na⁺和K⁺的平衡电位。由图2中的钠电流曲线和钾电流曲线可分别算出的钠电导和钾电导变化曲线如图3所示。由图3中曲线可看到g^Na和g^K随时间变化的情况。它们在纤维安静时数值都很低； 当膜电位突然去极到某一水平时，gN^a在一个短的潜伏期后迅速上升，达到顶点，但这时去极虽然仍在继续，gNa却又迅速下降。gNa的这种迅速上升和下降，是膜在兴奋过程中通透性改变的重要特征之一，前者称为激活，后者称为失活。失活被认为是造成兴奋膜的绝对不应期的关键因素。g^K的升高出现得较晚，变化率也较缓，但不表现失活，即增高的g^K将稳定于某一数值，直到去极取消后才以指数曲线的形式下降到原初的水平。当电压固定于不同程度的去极水平时，gNa和gK的变化幅度和速度亦有不同。一般去极程度越大，gNa的峰值以及达到这一峰值的速度也越大；但gNa和gK都有一个最大值，达到此值后，进一步的去极并不能使它再增大。这说明，通透性的变化是有一个限度的。

图3 由图2中钠电流和钾电流变化曲线算出的钠电导（中）和钾电导（下）变化曲线

上方曲线表示电压固定的数值，中、下方实线分别为去极引起的钠电导和钾电导变化情况。虚线表示膜的固定电压的去除时间及由此引起的膜电导的恢复情况

电压固定实验voltage clamp experiment

又称“电压钳制术”。系Hodgkin等(1949) 创立的著名的研究兴奋膜特性和与之有关的离子动力学基础的基本方法。Hodgkin等设计了一个用负反馈原理构成的电子学线路，在巨大神经轴突进行电压固定实验。其中金属丝电极E'插入轴突内一段距离，用来测量这一段膜电位数值，此电极连于一个高阻抗跟随器(X1)，后者的输出记录于E，同时输给反馈放大器(FBA)，将所测得的膜电位与实验中要求固定的膜电位不断进行比较，如果前者偏离了后者，则根据二者的误差信号，立即由放大器输出一定量的电流，经插入轴突的另一电极I'通向膜内，此电流的大小和方向刚好能抵消引起膜电位波动的膜电流，保持膜电位固定于规定的数值不变。整个过程都由电子学回路自动完成，不论膜电流怎样变化，E上总保持固定的电压值，这时所看到的变化，只是通过电极I'和膜外另一接地电极之间的电流变化，记录于I上。它虽然表示了用来抵消膜的离子电流的外加电流的变化情况，却正是我们要测定的膜电流变化的镜象。电压固定实验的数据就是由此而取得的。