毒物分离

免疫测定可直接测定尿和血清中某些毒物，如吗啡、巴比妥类安眠药等。活化分析检材也无需经过处理。但一般检测生物组织中所含毒物，则需选择适当方法先从大量“杂质”中将毒物分离，才能检验。

从组织（体液）中分离毒物的方法

方 法	分离的毒物
蒸馏法 微量扩散法 各种改进的Stas-Otto法 有机溶剂直接提取法 非离子型树脂（或活性炭）	挥发性毒物 挥发性毒物 非挥发性有机毒物 非挥发性有机毒物
吸附法 灰化法 湿氧化法 透析法	非挥发性有机毒物 金属毒物 金属毒物 有毒阴离子

挥发性毒物分离 常采用蒸馏法或微量扩散法。
蒸馏法 挥发性毒物的分子量一般较小，具有较高的蒸气压，在酸性水溶液中，多数能于较低的温度下随水蒸气蒸馏分离出来。亦有一部分毒物如烟碱和安非他明等，须在碱性水溶液的条件下，始能随水蒸气蒸馏分离。蒸馏后的残余物，尚可供无机毒物化验。馏液可供检验氰化物、卤素化合物、二硫化碳、醛类、酚类、苯胺、硝基苯、磷及其化合物等类毒物。馏液可直接测紫外吸收光谱。或取馏液10ml，用乙醚提取，将提取液中的乙醚蒸去，作气相色谱分析，检验苯、硝基苯、苯酚、甲酚以及水杨酸甲酯等毒物。分离此类毒物、检材愈新鲜愈好。由于检材的组成比较复杂，毒物的含量常甚低，因此，难以根据理论算出蒸馏液的浓度。
操作方法： 取胃内容物总量的1/3置于烧瓶内，加适量的重蒸馏水使成粥状，加10%酒石酸溶液2～3ml至呈酸性。另取一500～1000ml容量的烧瓶作水蒸气发生器，用玻管及冷凝管连接，接头处应密封。接受器用干冰冷却，如检验氢氰酸，则加1%NaOH约2～3ml，以防挥发。
若检材系脑或其他组织，取100～500g经冰冻，捣碎。余同胃内容物。过滤残余物，所得滤液经浓缩，可供提取非挥发性毒物。
微量扩散法 是一种简便的分离挥发性毒物的方法。分离后可做毒物的定量测定。将检材(血、组织匀浆)放在微量扩散皿的外槽内，将吸收液放入内槽中，加盖，留一小缝，从缝中将释放剂加于外槽内后，立即盖严。小心旋摇使释放剂与检材混合，放置一定时间，挥发性毒物从检材中释放、扩散，被吸收到吸收液中直到接近平衡 (一般2～3小时)。吸出内槽吸收液，供测定用。此法的应用见表。

水蒸气蒸馏装置

微量扩散皿

微量扩散法分离毒物

化合物	外 槽		内 槽 (ml)	扩散 时间 (h)
	检材(ml)	释放剂(ml)
一氧化碳	血1.0	10%H2SO4 1.0	PdCl2 2.0	1
氰化物	血2.0～4.0 组织匀浆5.0	或10% H2SO4 3～4滴	0.1N NaOH 3.3	3
乙醇	血0.8或 组织4.0	饱和K2CO3 1.0	K2Cr2O7- H2SO4 2.0	1～2
甲醇	血2.0或 组织5.0	同上	10%H2SO4 3.3	3
异丙醇 甲醛，乙醛	同上 血3.0或 组织5.0	同上 10%H2SO4 3～4滴	同上 0.15M NaHSO3 3.3	3 3
酚	血2.0～4.0 或组织5.0	同上	0.1N NaOH 3.3	3
硫化物	同上	同上	同上	3

非挥发性有机毒物分离 非挥发性有机毒物的分子量一般较大，化学结构较为复杂，大部分呈固体状态，能溶于有机溶剂，对人和动物具有显著的生理、药理作用和较强烈的毒性，吸收进入人体后，若剂量超过安全范围，可引起中毒，甚至死亡。
这类毒物，包括从自然界动物或植物体中分离得到的生物碱、甙类，以及人工合成的镇静剂、安眠药等化合物，是非常复杂的一类毒物。为了使它们从生物检材中分离出来，可利用其能溶于有机溶剂及或多或少能溶于酸性醇及酸性水中的特性，而蛋白质、淀粉及无机盐类一般不溶于乙醇、脂肪类不溶于水，便可用醇和水反复处理检材，以除去蛋白质、淀粉、脂肪和无机盐类等大量杂质，然后再进一步提纯毒物。
常用的非挥发性有机毒物的分离方法有六种，各有优缺点，应根据检材的不同情况和条件，进行挑选。
Stas-Otto法 此法已沿用百余年，是分离未知有机毒物的经典方法，曾经许多学者加以改良，将操作步骤简化或改变，但其基本原理未变，迄今仍为许多毒物分析室采用。此法适用于从含大量杂质的组织中，提取未知的酸性、碱性、中性或两性有机毒物，其优点是较其它未知毒物的分离方法检出率高。其缺点是操作过程冗长，步骤繁琐，回收率不高。
操作方法： 取检材总量的1/3～1/2，切细或制成组织匀浆，加乙醇适量，用10%酒石酸酸化，置水浴上回流30～60分钟，冷却，过滤。滤液在水浴上蒸发至糖浆状，加无水乙醇使溶解，滤过。滤液蒸发至糖浆状，加重蒸馏水溶解，便成酸性水溶液(若杂质多，可用无水乙醇反复处理)。用乙醚提取酸性有机毒物 (如巴比妥类安眠药、导眠能、眠尔通等)。经脱水和脱色处理，作定性和定量检验。于提取液的酸性水溶液中加入NaOH液使呈碱性，仍用乙醚提取碱性有机毒物(如生物碱类、利眠宁、安眠酮等)。所余之碱性水溶液中加盐酸使呈酸性，再加NH₄OH便呈弱碱性，用氯仿和异丙醇的3:1混合液提取两性有机毒物（如吗啡等）。
乙醇减压连续提取法 系根据Stas-Otto法改良，目前认为是较好的一种提取方法。
操作方法： 取肝250g加95%乙醇500ml和酒石酸5g，捣细，放提取瓶(1)中。加入乙醇直到乙醇溢出，流入锥形瓶(2)，瓶中预先装满无水乙醇。于蒸发瓶(3)中，加入无水乙醇约占瓶容积3/4。将瓶放在90℃水浴中，瓶上复盖棉罩保温。经水泵减压至14cmHg,(3)瓶中乙醇沸腾，由插在瓶口的毛细管漏入空气细流。乙醇蒸气经冷凝管冷凝后流入组织下层。组织的乙醇提取液由瓶(1)经瓶(2)汇集于瓶(3)。当瓶(1)中乙醇无色透明，提取即完成，约需几小时（一般提取法需几天）。将瓶(3)中乙醇提出液减压蒸发近干，加无水乙醇溶解、过滤。滤液蒸至近干。于提出物中加0.001N H2SO450ml，振摇30分钟溶解，过滤。瓶(3)中残渣再加0.001N H2SO450ml在沸水浴上加热溶解，过滤。合并两次滤液。供检查非挥发性有机毒物。

乙醇减压连续提取装置

1.提取瓶 2.锥形瓶 3.蒸发瓶 4.夹层冷凝管 5.水银压力计 6.温度计

直接提取法 此法毋须先用酸性乙醇提取，而有别于Stas-Otto法或其改良法。适用于含杂质较少的血、尿和胃内容物等检材。在一定的pH下，加有机溶剂直接提取毒物。常用的有机溶剂为乙醚、氯仿。多数有机毒物在乙醚中的溶解度较在氯仿为低。乙醚提取物含杂质一般较少，氯仿提取回收率较高。这一分离方法的优点是操作简便，迅速； 缺点是不适用于含杂质多的组织检材。且易产生乳化现象，使分层不易。
操作方法： 检材（尿液）用盐酸酸化后，加乙醚提取酸性和中性有机毒物(如水杨酸、巴比妥类毒物)。加氢氧化钠液，使酸性水溶液呈碱性(pH>12)，用乙醚提取碱性毒物（如生物碱类）。然后使之酸化，再加氢氧化铵液使成弱碱性，用3∶1的氯仿和异丙醇混合液提取两性化合物。
若检材系血，加磷酸盐缓冲液(pH7.4)后，用氯仿提取。
钨酸钠(或三氯化铝、硫酸铵)沉淀法 此法适用于酸性和中性的有机毒物的分离提取。组织检材先在捣碎器中制成匀浆，加蛋白质沉淀剂沉淀蛋白质，滤液依次在酸性和碱性条件下，用有机溶剂提取毒物。常用的蛋白质沉淀剂为钨酸钠、三氯化铝或硫酸铵等。此法优点是操作过程较简单，需时较短，不发生乳化现象； 其缺点是对碱性有机毒物的回收率低。
盐酸水解法 此法适用于分离在体内与蛋白质或葡萄糖醛酸结合生成结合体的毒物，如吗啡、酚噻嗪类。这类毒物因以结合形式存在，若不经水解，直接用有机溶剂提取，回收率甚低。水解使之成为游离体，则回收率显著提高。且不产生乳化现象。缺点是不适用于遇酸易分解的毒物。
操作方法： 检材（如肝或肾）加同体积的重蒸馏水，捣碎制成匀浆，加同体积的浓盐酸，在沸腾的水浴上加热5分钟，使之充分水解，置于冰浴中冷却，加60%氢氧化钠溶液至碱性，冷却后用乙醚提取有机毒物。
吸附法 此法系利用吸附剂吸附非挥发性有机毒物，再用适宜的有机溶剂将毒物洗脱。其优点是简便、快速、避免液-液提取的乳化现象。缺点是仅适用于血清、尿和滤过的胃内容物，主要用于定性，若作定量分析须严格控制条件。常用的吸附剂有非离子型树脂苯乙烯-二乙烯基苯的聚合物(如Amberlite XAD-2) 和活性炭。

吸附和洗脱装置

1.棉花2.吸附柱3.吸附剂4.抽气5.过滤管6.滤纸

操作方法： 20ml尿加3:2的无水碳酸钾和碳酸氢钠调至pH8～9。吸附柱通过3ml蒸馏水润湿，加入尿液，吸滤瓶减压，调节尿液流速使20ml尿液15至20分钟通过吸附柱(见图A)。吸附柱接过滤管(见图B)，滤纸用洗脱溶剂润湿。除去上端棉花。加洗脱溶剂氯仿：异丙醇(3:1)20ml洗脱。洗脱液加4滴6N HCI甲醇液，于80℃通空气流蒸去有机溶剂。残渣加100μl甲醇溶解，供薄层或气相色谱分析用。
非挥发性有机毒物的分离所得的粗提物常含有较多杂质，须经纯化，始可供确证试验用。纯化粗提物的方法中，以色谱法的效果最佳。
金属毒物分离 可采用灰化法或湿氧化法。
灰化法 此法适用于组织检材。检材先加热110℃干燥后，置于高温电炉中在450℃灰化，残灰用酸溶解，供检验金属离子。
湿氧化法 此法较常用，适用于各种检材。采用分析纯的HNO₃-H₂SO₄混合液破坏有机物质，取残液检验金属离子。其优点是方便，易行。缺点是有时需时较长，始能将有机质全部破坏。
操作方法： 检材100g切细(最好在110℃干燥)，移入锥形瓶，加浓HNO3掩盖，放1～2小时，在水浴上加热5～6小时。放冷后如有脂肪浮面上，可经玻璃棉滤去。硝酸溶液移入Kjeldahl烧瓶，加10ml浓H₂SO₄和数颗玻珠，加热微沸当颜色加深，缓缓加5ml HNO3，继续加热，如此反复加HNO3处理，至颜色不再变深，加热至发生白烟，冷后加水稀释供分析有毒金属，如疑有汞存在，瓶口应接冷凝管以减少其挥发。
有毒阴离子分离 通常采用透析法进行分离。所用的透析袋须经严格挑选，装入检材后使之浮于重蒸馏水中，不断搅拌，连续透析两次，每次不少于2小时。将每次所得透析液合并。中和后，低温减压蒸发浓缩至2ml，作有毒阴离子检验。