植物抗病基因工程genetic engineering of plant for disease resistance

应用基因重组技术改善植物抗病性的育种方法。常规抗病育种以有性杂交为基础，主要在种间进行。植物抗病基因工程以DNA重组技术为基础，可以跨越物种屏障，利用不同植物，甚至不同类生物包括微生物、动物和人的基因资源。植物抗病基因工程具有工程性的特点，在基因操作过程中强调合理设计，正确施工，保证称之为“目的基因”的DNA片段在植物细胞中扩增和表达。
步骤 按基因操作顺序，植物抗病基因工程的主要步骤包括分离鉴定目的基因、选择克隆载体、基因转移和转化植物的组织培养和再生(图1)。
目的基因 指编码特定性状的基因，在植物抗病基因工程中所用目的基因的产物与植物抗病性有关。它们或是编码颉颃蛋白的基因，或是编码植物代谢中与抗病性有关的酶以及病程中决定不亲和反应的植物抗病基因产物。
目的基因的克隆方法 分离目的基因首先要了解该基因编码的产物即蛋白质（或多肽）的性质，然后从基因文库中筛选具有该性状的克隆。根据目的基因的来源可以采用不同方法从植物中克隆鉴定抗病基因的方法有： ❶随机克隆植物基因组片段，根据产物的功能分析鉴定目的基因。
❷从抗、感品种基因组的微结构比较，寻找抗病基因特异性探针，从植物基因文库中钓取目的基因。
❸用限制性内切酶片段长度多态性(RFLP)特异性探针、T-DNA和植物转座因子等标记抗病基因，通过染色体巡查等方法克隆基因。
❹用随机引物扩增法(RAPD)分析抗感品种基因组的多态性，找出抗病基因标记探针后，进行基因克隆。
❺用基因组减量法进行抗病基因分离。
❻从基因产物（抗病蛋白或信息蛋白）入手克隆抗病基因等。以微生物克隆基因的方法为例： ❶鸟枪法是对基因文库中的所有克隆一一检测，直至找到具有目的性状的克隆。
❷聚合酶链式反应(PCR)方法是根据纯化的基因产物设计引物，再通过聚合酶链式反应扩增基因。
❸转座子标签法是从细菌中克隆基因最常用的方法。

图1 应用中间型(iv)载体转移外源DNA产生转基因植株的基本过程
(引自吴乃虎，1989)

目的基因的加工重组 目的基因作为完整的功能单位，要能在植物中表达和遗传，在转化植物之前要进行适当加工和重组。❶加入启动区，常用的有T-DNA序列上的启动区、花椰菜花叶病毒(CaMV)35s启动子和从植物本身分离的启动子，以35s启动子最常用。
❷加入转录的加尾序列如AATAAA，以保证转录终止和形成有活性的mRNA链。
❸插入内含子，有时可以提高表达产物含量。
❹加入翻译的启始和终止密码。
❺加入报道基因，以便于转化植物的检测。
目的基因表达策略 目前所用方法多以Ti质粒载体将目的基因随机插入植物染色体基因组进行结构性表达，但不符合植物防卫反应基因表达的时、空关系。因此，最好将目的基因与诱导性启动子相连，而该启动子受非特异性激发子调控。这一设想的特点是一个目的基因可以针对多种病原物，而且只在受病原物侵染的时间和地点充分表达，经济有效。
基因载体 能携带目的基因并具有转化能力的DNA分子。植物基因工程所用的载体需要能将目的基因引入植物基因组并在其中正确表达。能转化植物的基因载体有单链RNA植物病毒、单链DNA植物病毒、双链DNA植物病毒和Ti质粒。最常用的是Ti质粒载体。
Ti质粒载体的构建原理 是利用T-DNA的转移特性。为了消除转移过程中T-DNA的致瘤性，在构建载体时要先将T-DNA中的致瘤基因缺失，保留T区两侧具有25个碱基对(bp)重复顺序的端臂和有报道基因作用的冠瘿碱合成酶基因。Ti质粒上的另一区段(vir区)，由于具有推动T-DNA向植物转移的功能，构建载体时也应保留。
Ti质粒载体的类型 主要有外源基因插入共合载体和双元载体两类(图2)。❶外源基因插入共合载体。以pGV3850为例，该质粒中的致瘤基因被普通质粒pBR322取代。使用时先将目的基因克隆到一个供体质粒pLGVneo1130上。由于该质粒是以pBR322与植物选择记号(OCS)和细菌选择记号(Km)构建成的重组质粒，可以在大肠杆菌和根癌土壤杆菌中来回穿梭和稳定复制。因此，将pGV3850和pLGVneo1130共同培养后，目的基因就会利用pBR322的同源序列发生同源重组，形成质粒共合体，其中目的基因包在T-DNA端臂之间。
❷双元载体。是把Ti质粒上对T-DNA转移有关的两个区段即T区和vir区分别构建在两个彼此相容的质粒上。如Bin19是含T区片段的大肠杆菌宿主质粒，pAL4404是含vir片段的无T-DNATi质粒的根癌土壤杆菌。使用时，先将目的基因插到含T区片段的质粒中，然后用三亲交配法将此质粒转移进含vir区片段Ti质粒的根癌土壤杆菌。
基因转化 指将目的基因运送进入植物细胞的过程，目的基因构建在载体上，可以用不同方法转化植物细胞。基因转化成功意味着目的基因进入植物细胞后被整合到植物基因组的适当部位，而且有表达产物。
基因转化方法 有直接转化和根癌土壤杆菌转化两种方法，后者又叫载体介导的转化法。❶直接转化。包括各种机械、物理和化学诱导的方法，如基因枪法、微注射法、电攻击法、聚乙二醇(PEG)诱导法和脂质体包裹法等。
❷根癌土壤杆菌转化法。包括使用各种类型Ti质粒衍生的载体，有原生质体共培养和叶盘转化等方法。
转化植物的鉴定 除报道基因有助于分析转化效果外，还需要用目的基因探针杂交检测、基因产物的免疫测定和生化功能的分析等。但作为抗病基因转化植物的结果，最终还决定于抗病性的变化。
细胞、组织培养 无论是用原生质体还是用叶盘法进行转化都要进行组织培养，使转化细胞成株。现已获得转基因工程植物50多种，抗病基因工程植物10多种，且大多为双子叶植物。
现状 植物抗病基因工程可以针对各类病原物进行，但目前只有在植物抗病毒基因工程方面有所突破。

图2 Ti质粒载体的类型

A: 外源基因插入共合载体pGV3850的示意图。波纹线代表pBR322的DNA，三角形代表不同于Amp的另一种抗生素抗性基因(引自Caplan A.等，1983)
B: 双元载体系统示意图。BL和BR分别代表T-DNA的左右边界序列，MCS为多重克隆位置，DNA以单线表示(引自谢友菊，1992)

植物抗病毒基因工程 根据所用目的基因已在病毒外壳蛋白、卫星RNA和病毒反义RNA基因工程中获得不同程度成功。以核酶、复制酶和转移蛋白等基因为目的基因的转基因研究也有进展。另外，用二个以上相同或不同的目的基因产生多价抗病毒转基因植物的研究也取得初步成功。
利用病毒的外壳蛋白基因 1986年美国比奇(Beachy,R.N)最早用烟草花叶病毒外壳蛋白基因转化烟草和番茄获得成功。通过这一途径还获得抗苜蓿花叶病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、黄瓜花叶病毒等转基因植物。此法相对安全，主要危险性是转基因植物编码的病毒外壳与其他虫传病毒的RNA装配。
利用病毒的卫星RNA 成功的例子是黄瓜花叶病毒卫星RNA的cDNA转移到植物中获得的抗黄瓜花叶病毒基因工程转化植株。主要危险是病毒卫星RNA不彻底抑制其辅助病毒，突变后还会和一些病毒互补，使病害加重。
利用病毒反义RNA 是将病毒基因组反向连结在启动子后。转化植物细胞后即可以产生反义，可以和病毒RNA互补的RNA。因此，病毒侵染植物后，病毒的RNA和转基因植物产生的反义RNA形成互补双链，从而抑制了病毒的复制和翻译。用这一方法已获得抗烟草花叶病毒的转基因烟草。主要问题是细胞中反义RNA的含量不高，病毒大量侵染时抗病效果较差。
植物抗病原真菌的基因工程 最早关注的目的基因有几丁酶基因和β-葡聚糖酶基因，这两种酶在体外对真菌细胞壁有降解作用。1991年美国布罗格利(Broglie,R)等发现菜豆内几丁酶在转基因烟草和油菜豆中是结构性表达的，因而增强对茄丝核菌(Rhizoctonia solani)的保护作用。正在进行转基因研究的目的基因还有几丁质结合外源凝集素、钝化核糖体蛋白、真菌毒素还原酶等。
植物抗病原细菌的基因工程 应用丁香假单胞烟草致病变种(Pseudomonas syringae pv. tabaci)的毒素解毒酶作为目的基因转化烟草，产生的转基因烟草已证明对烟草野火病具有很强的抗病性。以天蚕素(Cecropin B)基因和T4噬菌体溶菌酶基因作为目的基因转化植物已经成功，但转基因植物的表达尚待改进。