分子杂交技术molecular hybridizationtechnique

不同来源的核酸单链根据碱基配对原则形成杂交分子的技术。具有同源核苷酸序列的单链DNA或RNA，当混合在一起时，其特定的同源区段将会退火，形成双链的结构。如果退火的核酸来自不同的生物有机体，所形成的双链分子叫做杂种核酸分子。能够杂交形成杂种分子的不同来源的DNA，亲缘关系比较密切，反之则比较疏远。因此，DNA/DNA的杂交作用，可以用来检测不同生物有机体之间是否存在亲缘关系；而且，形成DNA/DNA或DNA/RNA杂种分子的能力，还可以用来确定核酸片段中某一特定基因的位置。核酸杂交技术是现代DNA分析方法的基础。
在大多数的核酸杂交反应中，经过凝胶电泳分离的DNA或RNA分子，都是在杂交之前通过毛细管作用或电导作用，按其凝胶上的位置，原封不动“复印”到滤膜上去的。常用的滤膜有硝酸纤维素滤膜、二乙氨基乙基纤维素(DEAE)滤膜和重氮苯氧甲基纤维素(DBM)滤膜等。滤膜便于操作和保藏。滤膜的选用主要是取决于核酸的特性、分子大小，以及杂交过程涉及的步骤、次数和敏感性等多种因素。在早期多用硝酸纤维素滤膜。但因其不能滞留小于150bp的DNA片段，又不能同RNA结合，所以受到一定的限制。1980年，史密斯(G. E. Smith) 和萨默斯 (M. D. Sum-mers)发现，应用1M的醋酸铵和0.02N的NaOH缓冲液代替SSC缓冲液，可改善硝酸纤维素滤膜对小片段DNA的滞留能力。1980年汤姆斯(P. S. Thomes)报道，经广泛变性的RNA，也可容易地转移到硝化纤维素滤膜上。1977和1979年阿尔温(J. C.Alwine)等应用DBM滤膜转移结合DNA及RNA。接着利维(A.Levy) 等 (1980年)又发现，小片段的DNA能够有效地转移到这种滤膜上，其办法是在通过毛细管作用或电导作用之前，小片段的DNA先在低浓度(<4%)的聚丙烯酰胺凝胶上作分部分离。
索森DNA吸印杂交技术 根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同DNA或RNA探针的杂交作用，检测这些被“吸印”的DNA片段。这种方法由索森(E.Southern)于1975年首先提出并设计，故叫索森吸印杂交技术。应用硝酸纤维素滤膜进行索森吸印实验，只要当该滤膜结合上两种互补链之一，便能够成功地发生核酸的杂交作用。琼脂糖凝胶电泳分离的DNA片段，经过碱变性作用之后，平铺在已用电泳缓冲液饱和了的两张滤膜上，在凝胶上部覆盖一张硝酸纤维素滤膜，其上加一叠干滤纸，最后再加载一重物。这样由于干滤纸的吸引作用，凝胶中的单链DNA便随着电泳缓冲液一道转移，而一旦同硝酸纤维素滤膜接触，就会牢固地缚结在它上面。这些DNA片段（单链）系严格按照它们在凝胶中的谱带模式原位吸印于滤膜上的，在80℃下烘烤2小时，DNA片段就会固定在硝酸纤维素滤膜上。然后，将此滤膜移放在加有放射性同位素标记探针的溶液中，进行核酸杂交。这些探针是同被吸印的单链核酸互补的RNA或DNA，一旦它们同硝酸纤维素滤膜上的单链互补DNA杂交后，就很难再解链。用漂洗法洗去没有杂交的游离探针分子，用X光底片所得的放射自显影图片，同溴化乙锭染色的凝胶谱带作对照，便可检出同探针的核苷酸序列同源的限制片段。萨瑟恩吸引杂交方法几乎可以同时构建出DNA分子的物理图和遗传图，在分子生物学及基因克隆实验中的应用极为普遍。
诺森RNA吸印杂交技术 吸印杂交技术的应用，逐步从DNA扩展到包括RNA和蛋白质转移杂交在内的更加广泛的研究领域。但由于RNA分子不能同硝酸纤维素滤膜结合，所以索森技术不能直接地应用于RNA的吸引转移。1979年阿尔温发现，将电泳凝胶中的RNA转移到叠氮化的或其他化学修饰的活性滤纸上，通过共价交联作用可永久地结合在一起。这种方法同索森的DNA吸印技术十分类似，所以称诺森RNA吸印技术。RNA分子同活性滤纸共价结合得十分牢固，但可以通过在杂种核酸分子呈不稳定状态的温度条件下漂洗杂交滤纸的办法，洗脱上次杂交反应中同RNA分子同源结合的放射性探针分子。因此，这一类吸印转移的滤纸可以多次反复使用。活性滤纸不仅能同RNA分子牢固地结合，而且能相当有效地结合变性的DNA分子。事实上叠氮化的活性滤纸，比硝酸纤维素滤膜能更有效地转移并结合小片段DNA。最近还发现，在适当条件下，硝酸纤维素滤膜能直接吸印RNA。
菌落（或噬菌斑）杂交技术 1975年，格伦斯坦(M.Grunstein)和霍格内斯 (D. S. Hogness) 对索森吸引技术作了一些修改，发展为菌落杂交技术。1977年本顿(W. D. Benton)和戴维斯(R. W. Davis)提出与此类似的筛选含有克隆DNA的λ噬菌斑杂交技术。这类技术是把菌落或噬菌斑转移到硝酸纤维素滤膜上，使溶菌后变性的DNA同滤膜原位结合。带有DNA印迹的这些滤膜烤干后，同放射性同位素标记的特异性DNA或RNA探针杂交，漂洗除去未杂交的探针，根据放射自显影所揭示的同探针序列具有同源性的DNA印迹位置，对照原来的平板，便可以从中挑选出含有所期望的插入序列的菌落或噬菌斑。菌落杂交或噬菌斑杂交也叫原位杂交。因为生长在培养基平板的菌落或噬菌斑是按照其原来的位置不变地转移到滤膜上，并在原位发生溶菌、DNA变性和杂交作用。要检测真核基因组克隆中所希望的重组分子菌落或噬菌斑，往往要检测大量菌落或噬菌斑，而原位杂交技术具有特殊的价值。