免疫组织化学技术immunohistochemical method

是利用抗原与抗体特异结合的原理，对组织中某些蛋白和多肽类物质进行定性、定位和粗定量分析的一种研究技术。其基本过程是：先提取欲测抗原并制取相应抗体，再用特殊标记物标记此种抗体，然后用这种标记了的抗体处理组织切片，标记抗体即被结合在组织切片中的欲测抗原上。于是，在显微镜下即可根据标记物的出现部位和密度以确定欲测抗原的存在部位和多少。此外还有一种间接免疫组织法，亦称双抗体法，需要制取和标记第一抗体的抗体，即第二抗体，用标记了的第二抗体再通过第一抗体去追踪欲测抗原。

免疫组织化学技术

免疫组织化学技术是把免疫学方法和荧光染色或酶标记方法相结合的一种组织化学技术。以荧光染料或酶标记的特异性抗体作为试剂，检出细胞内的抗原（或抗体）。其基本方法是把抗原物质多次给予动物体，使之产生相应的抗体。然后将抗体（免疫球蛋白） 自血清中分离出，用荧光染料或辣根过氧化物酶标记，制成荧光标记抗体溶液或酶标记抗体溶液。以这种标记的特异性抗体溶液与含有相应抗原或抗体的组织或细胞作用，显示组织内或细胞内的抗原或抗体成分。免疫组织化学方法可分为直接显示法和间接显示法两种。
(1)直接显示法： 用荧光标记或酶标记的特异性抗体作为试剂，浸染含有相应抗原的标本，使标记抗体与标本中的相应抗原进行特异性结合，以检出组织或细胞内的抗原成分(图1)。

图1 直接法显示组织内抗原

1.载物片 2.切片 3.抗原 4.标记抗体

(2) 间接显示法： 间接显示法包括夹层法和双层法两种方法。
❶夹层法：显示细胞内抗体，首先用相应的特异性抗原处理含有抗体的细胞，然后洗去多余的未与标本内抗体结合的抗原，再用荧光染料或酶标记的特异性抗体溶液浸染标本，则中间的抗原一方面与标本中细胞内的抗体结合，另一方面与表层的标记抗体结合，在细胞内抗体存在部位呈现荧光或酶反应，从而证明细胞内的抗体(图2);
❷双层法：显示组织内抗原或抗体是以抗原免疫动物，使之产生相应抗体(抗体Ⅰ)，再以抗体(Ⅰ)免疫另一种动物，使之产生抗抗体(抗体Ⅱ)。用荧光染料或酶标记抗抗体(抗体Ⅱ)，用标记的抗抗体(抗体Ⅱ)定位组织内或细胞内的抗原或抗体(抗体Ⅰ)。抗原的间接显示法是首先用未标记的抗体Ⅰ处理含有抗原的标本，形成抗原抗体(Ⅰ)复合物。然后再以标记的抗体Ⅱ浸染标本，使抗体Ⅱ与抗原抗体(Ⅰ)复合物结合，间接证明标本内的抗原成分(图3)。间接法较直接法敏感。

图2 夹层法显示细胞内抗体

1.细胞内抗体 2.抗原 3.标记抗体

图3 双层法显示组织内抗原

1.抗体(Ⅰ) 2.标记抗抗体(抗体Ⅱ)

用荧光染料标记的抗体处理的标本，可用荧光显微镜观察。在标记抗体的存在部位呈现特异性荧光； 用酶标记的抗体处理的标本，需要进一步用二氨基联苯胺和过氧化氢作用，使它与标记在抗体上的酶发生反应后，呈现棕褐色反应产物，在普通光学显微镜下观察。
用免疫反应替代化学反应有很大优点。首先，抗体是检出组织内抗原的极锐敏的试剂，有高度特异性。第二，原则上，凡要检查的物质具有抗原性，都能应用此种方法显示，故它的应用范围颇为广泛。例如能定位腺细胞内的各种酶、激素，直接证明各种腺细胞的分泌功能。检测浆细胞中和淋巴细胞表面免疫球蛋白的性质和淋巴细胞表面的分化抗原和受体，观察淋巴细胞的分化和鉴定淋巴细胞不同功能的亚群等。免疫组织化学技术是进行细胞学和免疫细胞学研究的重要手段。其缺点是操作过程较复杂，参与反应的因素多，易产生非特异性染色，结果判断较难，需要作多种严格的对照。