临床血清学诊断

当机体受病原微生物侵袭或人工接种抗原性物质后，可以产生特异性抗体。根据抗原和相应抗体在体外能发生特异性结合的原理，在不同的实验条件下有多种抗原抗体反应(表1)。因抗体一般得自人或动物的血清，故这些反应通称血清学诊断。在血清学诊断中，可用已知抗原检测未知抗体，以协助临床诊断某些疾病；反之，也可用已知抗体检测未知抗原，借以鉴定病原微生物。

表1 血清学试验的种类

	抗原	抗 体	电解质	其他
凝集试验 沉淀试验	颗粒性抗原 可溶性抗原	凝集素 沉淀素	+ +	- -
补体结合试 验	颗粒性或可 溶性抗原	补体结合抗 体	+	补体
中和试验	细菌外毒素、 病毒	抗毒素、中 和抗体	+	细胞、鸡 胚、动物

凝集试验 完整的细菌细胞、螺旋体或血细胞等颗粒性抗原与特异性抗体结合，在适当的电解质存在下，经一定时间，颗粒性抗原与抗体结合形成的复合物凝集成肉眼或显微镜可观察到的团块，此现象为凝集反应。凝集试验分直接凝集试验、间接凝集试验和间接凝集抑制试验。
(1) 直接凝集试验： 简称凝集试验，是颗粒性抗原与相应抗体直接结合所出现的凝集现象。方法有玻片法和试管法，前者主要定性，系将含有已知抗体的诊断血清与待检菌液各放一滴在玻片上混合。数分钟后，若出现凝集现象，是为阳性反应。此法简便、快速，常用于从临床标本分离得的菌株的鉴定或分型。人类红细胞ABO血型的测定也用本法。试管法主要用于定量。操作时是将受检者血清用生理盐水作倍比稀释，然后加入等量抗原。最高血清稀释度仍呈现明显凝集者，为该血清的效价（或称滴度）。判定结果时，应考虑当地人群抗体水平、有否预防接种史和过去患病史。临床上常用的有肥达试验和外斐试验等。肥达试验是以伤寒杆菌的菌体和鞭毛抗原、副伤寒杆菌甲、乙的鞭毛抗原来测定伤寒病人血清抗体。外斐试验是以与立克次体有共同抗原的变形杆菌OX₁₉、OX₂或OX_K株测定立克次体病人血清抗体。
(2) 间接凝集试验(图1)。是指将可溶性抗原或抗体先吸附于一种与免疫无关、一定大小的颗粒状物体（载体）表面，然后与相应抗体（或抗原）作用而出现的凝集试验。常用的载体颗粒有人的O型或绵羊、家兔等动物红细胞、聚苯乙烯胶乳(0.6～0.7μm直径)或矽酸铝、炭末颗粒等。若用红细胞作载体颗粒，又称为间接血凝试验。由于载体颗粒增大了可溶性抗原（或抗体）的反应面积，故敏感度比直接反应为高。本试验可测定细菌、病毒、螺旋体等微生物性抗体，亦可协助诊断血吸虫病等寄生虫性疾病以及类风湿关节炎等自身免疫病。检测原发性肝癌患者血中的甲胎蛋白等试验亦属之。
(3) 间接凝集抑制试验： 若先将可溶性抗原与抗体混合，隔一定时间加入抗原致敏的载体颗粒，则因抗体已被中和，不再发生凝集现象。例如检测妊娠妇女尿中的绒毛膜促性腺激素。
沉淀试验 细菌浸出液或培养滤液、组织浸出液、动物血清等可溶性抗原与特异抗体结合，经一定时间，形成肉眼可见的沉淀物，称沉淀试验。常用沉淀试验如下：
(1) 环状沉淀试验： 是在小口径试管内先加已知抗体血清，再覆盖待检抗原。数分钟后，若两层液面交界处出现白色沉淀环，为阳性反应。用于炭疽病的辅助诊断(Ascoli试验)、法医上鉴别血迹、媒介昆虫嗜血性等。
(2) 单向琼脂扩散试验： 将抗体混合于琼脂中，倾注于平皿或玻片上。凝固后打孔，将抗原加入孔内，使其向四周自由扩散。抗原与抗体形成复合物的直径与抗原浓度成正比，从事先求得的标准曲线中可推算出抗原含量。本试验主要用于检测标本中各种免疫球蛋白或血清中补体组分的含量。
(3) 双向琼脂扩散试验(图2): 制备琼脂板后，打成多个小孔，然后将抗原和抗体分别注入小孔，令两者相互向四周自由扩散。经一定时间后，观察有无白色沉淀线形成。主要用于测定甲胎蛋白，分析和鉴定复杂的抗原组分等。
(4) 对流免疫电泳： 以琼脂制板后，打孔，在阴极端孔加抗原，阳极端孔加抗体，通电一定时间后，观察抗原抗体两孔间有无白色沉淀线出现，若有为阳性。本试验因限定抗原抗体向相对方向移动，故可提高敏感度，比双向琼脂扩散试验敏感约10～15倍。且一般在1小时内可得结果。本试验常用以测定血清中的甲胎蛋白、乙型肝炎表面抗原等。
(5) 电免疫扩散法(图3): 又称火箭电泳，是在含有已知抗体的琼脂板阴极端打一排小孔，各孔加入定量待检样品及标准抗原。电泳后，抗原在扩散过程中，与抗体结合后在适合比例部分形成锥形沉淀峰，状如火箭，故名。沉淀峰的高低与抗体浓度成正比，同标准品比较可推算出标本中的抗原含量。本试验敏感度与单向琼脂扩散试验相仿，但结果一般当天可得，而后者至少24小时。

图2 双向琼脂扩散试验示意图

(6) 免疫电泳(图4):是将琼脂电泳和双向琼脂扩散两法结合起来，用于分析抗原组成的一种定性试验。先将待检抗原在琼脂板小孔中进行电泳，再在琼脂板中央挖一横槽，加入已知相应免疫血清。经一定时间相互扩散后，在最适比例部位形成沉淀弧。根据沉淀弧的数量、位置和外形，即可分析样品中所含的成分及其性质。本试验主要用于血清蛋白组成分析，测定抗原或抗体的纯度等。

图3 电免疫扩散法（火箭电泳）

图4 免疫电泳

正常人血清经免疫电泳后，显示白蛋白和几种球蛋白的沉淀弧

补体结合试验(图5) 补体是存在于人和动物血清中的一组球蛋白，本身无特异性，可与任何抗原抗体复合物结合，但不能与游离的抗原或抗体结合。利用此原理，发展成补体结合试验。本试验包括两个系统、五种成分。一为被检系统，即已知抗原（或抗体）和被检的抗体（或抗原）; 另一为指示系统，包括绵羊红细胞和特异溶血素。补体采用豚鼠的新鲜血清。方法程序是先将补体加入被检系统，作用一定时间后加入指示系统。继续作用一定时间，观察结果。若不发生溶血，表示被检系统的抗原与抗体是相应的，二者特异地结合后固定了补体，故指示系统不溶血，为补体结合反应阳性。反之，溶血者为补体结合反应阴性。本试验操作较复杂，但敏感性比沉淀反应高。常用于测定病人血清中的抗体，以辅助诊断病毒性疾病或螺旋体病等，亦可用来鉴定自患者分出的未知病毒、立克次体等。

图5 补体结合反应图解

上、中： 补体结合反应阴性（溶血）
下： 补体结合反应阳性（不溶血）

抗链球菌溶血素O试验

是中和试验中的一种。乙型溶血性链球菌产生的溶血素O，能溶解人或兔的红细胞。且因抗原性强，患者有相应抗体形成。试验方法是先将病人血清作一系列稀释，再加入链球菌溶血素O。37℃经一定时间后，加入兔红细胞。若血清中含有相应抗体，则溶血素O毒性被中和，不出现溶血现象。当该抗体滴度增高到400单位以上时，表明患者在不久前或目前有溶血性链球菌感染，结合临床症状，有助于风湿病的诊断。
免疫荧光法(图6) 或称荧光抗体法，是一种抗原抗体特异性与形态学相结合的方法。原理是某些荧光素，在一定条件下可与抗体分子结合，但不影响抗体与抗原特异性结合的性能。用这种荧光抗体着染标本，置于荧光显微镜下观察，可对标本中相应抗原进行鉴定和定位。常用荧光素有异硫氰酸荧光素 (FITC)、罗丹明(RB₂₀₀)等。基本方法有直接法、间接法和补体法三种。直接法是将荧光抗体直接滴加于玻片的标本上，半小时后冲洗去多余荧光抗体，若有相应抗原，则在镜下可见发荧光的抗原抗体复合物。本法简便，缺点是每检查一种抗原，事先须制备与其相应的荧光抗体。间接法是先使未标记特异性抗体与相应抗原结合，然后再滴加荧光标记的抗免疫球蛋白抗体（或称抗抗体），阳性时，镜下可见抗原-抗体-抗抗体复合物。本法优点是制备一种荧光抗抗体后，可用于多种抗原、抗体系统的检查，且敏感度较直接法为高。补体法的原理与间接法相似。不同处是用免疫血清处理标本后，加上富含补体的新鲜豚鼠血清，使标本中的抗原形成抗原-抗体-补体复合物。然后用抗豚鼠补体C3的荧光抗体染色，使上述复合物发出荧光。荧光抗体法在临床检验中主要用于各类病原微生物的快速诊断，在研究工作中可在细胞水平上直接观察和鉴定抗原或抗体或两者的复合物。

图6 免疫荧光法

表2 临床血清学诊断试验

试 验	举 例
凝集试验 直接凝集试验	伤寒和副伤寒（肥达试验）、斑疹伤 寒等（外斐试验）、波浪热、多种 病原菌
间接凝集试验
间接血凝试验 反向间接血凝试验 间接胶乳试验 间接凝集抑制试验 冷凝集试验 嗜异性凝集试验 病毒性血凝抑制试验 沉淀试验	乙型肝炎表面抗体 乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白 梅毒、类风湿性关节炎 妊娠试验 支原体性原发性非典型肺炎 传染性单核细胞增多症 流感、风疹
环状试验	肺炎和链球菌等急性感染(C反应 性蛋白试验)、炭疽(Ascoli试 验)、血迹（法医）、昆虫嗜血性
絮状试验 单向扩散沉淀试验 双向扩散沉淀试验 对流免疫电泳 补体结合试验	梅毒（康氏试验） 各类免疫球蛋白、补体组分 甲胎蛋白、白喉毒素(Elek试验) 甲胎蛋白、乙型肝炎表面抗原 梅毒（华氏试验）、立克次体病、多 种病毒病
中和试验	风湿病(抗链球菌溶血素O试验)、 细菌外毒素引起的疾病、多种病 毒病
免疫荧光试验 放射免疫试验 免疫酶试验	多种病原体 乙型肝炎 麻疹、风疹、流行性腮腺炎

同位素标记技术 是将同位素分析的灵敏性和抗原抗体反应的特异性两者结合的测定技术。在一定条件下，以放射性同位素(131I、125I、3H、14C、32P等)标记抗原或抗体，然后再与相应抗体或抗原进行反应。采用双抗体法、硫酸铵法或固相吸附法等将游离的和结合的同位素物质进行分离后，再分别计数、计算，并从标准曲线上查出待检标本中的抗原或抗体含量。本技术灵敏度很高，能测出每ml中ng(10-9g)甚至pg(10-12g)的含量水平。缺点是需特殊仪器，且抗原、抗体的纯度要求较严格，影响实验结果的干扰因素亦较多。本技术可用于乙型肝炎抗原、甲胎蛋白，以及垂体激素、血管紧张素、cAMP等测定。
免疫酶染色法 本法的原理和过程与免疫荧光法相似，不同处是用酶来标记抗体。酶标抗体与相应抗原结合后，在合适的酶底物作用下，产生一种在光学显微镜下可见的不溶性带色反应产物。目前采用的酶大多为碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶等。免疫酶的优点是特异性强、灵敏度高，设备要求较简、方法易行、分析快速，试剂半衰期长、标本片可长期保存，无放射损伤等。目前本法应用范围日趋广泛，有取代放射免疫法、荧光抗体法等之势。
免疫电子显微镜技术 用铁蛋白等电子致密物质标记抗体，然后与细菌或病毒等抗原反应，在电子显微镜下观察。本技术是一种研究亚细胞水平免疫学的良好方法，可用于病毒、细菌等抗原反应，以及免疫性疾病的发病机理等方面研究。
临床上使用的血清学诊断试验见表2。