畜禽衣原体病间接血凝试验操作技术

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(一)材料准备

1．1%阳性抗原致敏红细胞：为鹦鹉热衣原体纯化抗原致敏公绵羊红细胞。

2．1%正常抗原致敏红细胞：致敏红细胞有未冻干和冻干红细胞两种剂型，按说明书使用。

3。血清：

(1)阳性血清：血凝效价1∶2048－1∶4096。

(2)阴性血清：血凝效价≤1∶4，按说明书使用。

(3)被检血清：按常规方法采血、分离血清，要求不溶血，无腐败，应在血清中加入0．01%硫柳汞或0．2%叠氮钠防腐。然后根据动物种类按下列不同温度和时间进行灭能。

4．稀释液：用含1%健康兔血清(经1∶2)稀释后65℃30分钟灭能)的pH7．2PBS。

15磅高压灭菌30分钟。

5．试验器具：

(1)微量反应板：为8×12孔V型底有机玻璃反应板。

(2)微量吸液器：50毫升和25微升各若干支，或用磨口玻璃盐水接头滴管，每滴50微升，再套上12号兽用针头(磨口)，每滴25微升。

(3)微型混合器一台。

(二)正式试验

1．操作步骤。

(1)血清稀释液滴加：从第1－8孔每孔滴加稀释液50微升，每份被检血清各占1排。

(2)血清稀释：用微量吸液器吸取被检血清50微升入第1孔，充分混匀后再吸取5微升入第2孔中……依次作倍比稀释至第8孔(1∶128)，混匀后弃去50微升。

(3)致敏红细胞滴加：从第1－8孔，每孔滴加1%阳性抗原致敏红细胞25微升。

(4)对照试验：

①阳性抗原致敏红细胞空白对照1孔；

②正常抗原致敏红细胞空白对照1孔；

③阳性血清+阳性抗原致敏红细胞1孔；

④阳性血清+正常抗原致敏红细胞1孔；

⑤阴性血清+阳性抗原致敏红细胞1孔；

⑥阴性血清+正常抗原致敏红细胞1孔。

2．反应术式及结果举例见表。

3．结果判定。

(1)凝集程度的标准：

#：红细胞全部凝集，形成一层均匀的膜，布满整个孔底；

：红细胞在孔底形成一层薄膜，面积比前者稍小；

++：红细胞在孔底形成薄层凝集，边缘松散或呈锯齿状；

表2－14 间接血凝试验术式及结果举例

〔注〕表中所示被检血清的血凝效价为1∶128。

呈现“++”以上的凝集判为阳性。

+：红细胞在孔底呈稀疏、散在、少量凝集，孔底呈小圆点；

±：红细胞沉于孔底，但周围不光滑或中心有空斑；

-：红细胞完全沉于孔底，呈光滑的圆点。

(2)对照试验：应出现如下结果试验方可成立，否则应重复试验；

①阳性抗原和正常抗原致敏红细胞对照均无自凝现象(-)；

②阳性血清+阳性抗原致敏红细胞呈强阳性凝集(#)；

③阳性血清+正常抗原致敏红细胞为阴性反应(-)；

④阴性血清+阳性抗原致敏红细胞为阴性反应(-)；

⑤阴性血清+正常抗原致敏红细胞为阴性反应(-)。

(3)被检血清判定标准：

①哺乳动物血清：

血凝效价≥1∶64者判为阳性。

血凝效价≤1∶16者判为阴性。

血凝效价介于二者之间的判为可疑。

②禽类血清：

血凝效价≥1∶16者判为阳性。

血凝效价≤1∶4者判为阴性。

血凝效价介于二者之间的判为可疑。