猪传染性萎缩性鼻炎血清凝集试验操作技术

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(一)材料准备

1．抗原：按说明书要求使用。

2．标准阳性和阴性对照血清：按说明书使用。

3．被检血清：必须新鲜，无明显蛋白凝固，无溶血现象和无腐败气味。

4．稀释液：为pH7．0磷酸盐缓冲盐水。配法为Na₂HPO₄·12H₂O2．4克(或Na₂HPO₄1．2克)，NaCl6．8克，KH₂PO₄0．7克，蒸馏水1000毫升，加温溶解，两层滤纸滤过，分装，高压灭菌。

(二)操作方法

1．试管凝集试验。

(1)被检血清和阴性、阳性对照血清同时置56℃水浴箱中灭能30分钟。

(2)血清稀释方法为每份血清用一列小试管(口径8－10毫米)。第一管加入缓冲盐水0．8毫升，以后各管均加入0．5毫升，加被检血清0．2毫升于第一管中。换另一支吸管，将第一管稀释血清充分摇匀，吸取0．5毫升加入第二管，如此用同一吸管稀释，直至最后一管，取出0．5毫升弃去。每管为稀释血清0．5毫升，一般稀释到1∶80，大批检疫时可稀释到1∶40；阳性对照血清稀释到1∶160－1∶320；阴性对照血清至少稀释到1∶10。

(3)向上述各管内添加工作抗原0．5毫升，振摇使血清和抗原充分混合。

(4)放入37℃温箱18－20小时。然后取出在室温静置2小时，记录每管的反应。

(5)每批试验均应设有阴、阳性血清对照和抗原缓冲盐水对照(抗原加缓冲盐水0．5毫升)。

(6)结果判定。

“”：表示100%菌体被凝集。液体完全透明，管底覆盖明显的伞状凝集沉淀物。

“”：表示75%菌体被凝集。液体略呈浑浊，管底伞状凝集沉淀物明显。

“++”：表示50%菌体被凝集。液体呈中等程度浑浊，管底有中等量伞状凝集沉淀物。

“+”：表示25%菌体被凝集。液体不透明或透明度不明显，有不太显着的伞状凝集沉淀物。

“-”：表示菌体无凝集。液体不透明，无任何凝集沉淀物。细菌可能沉于管底，但呈光滑圆坨状，振荡时呈均匀浑浊。

当抗原缓冲盐水对照管、阴性血清对照管均呈阴性反应，阳性血清对照管反应达到原有滴度时，被检血清稀释度≥10出现“++”以上，判为猪萎缩性鼻炎血清阳性反应。

2．平板凝集试验。

(1)被检血清和阴、阳性对照血清均不稀释。可以不加热灭能。

(2)于清洁的玻璃板或玻璃平皿上，用玻璃笔划成约2平方厘米的小方格，以1毫升吸管在格内加一小滴血清(约0．03毫升)，再充分混合一铂圈(直径8毫米)抗原原液，轻轻摇动玻璃板或玻璃平皿，于室温(20－25℃)放置2分钟，室温在20℃以下时，适当延长5分钟。

(3)每次平板试验均应设有阴、阳性血清对照和抗原缓冲盐水对照。

(4)结果判定。

“”：表示100%菌体被凝集。抗原和血清混合后2分钟内液滴中出现大凝集块或颗粒状凝集物，液体完全清亮。

“”：表示约75%菌体被凝集。在2分钟内液滴有明显凝集块，液体几乎完全透明。

“++”：表示约50%菌体被凝集。液滴中有少量可见的颗粒状凝集物。出现较迟缓，液体不透明。

“+”：表示25%以下菌体被凝集。液滴中有很少量仅仅可以看出的粒状物。出现迟缓，液体浑浊。

“-”：表示菌体无任何凝集。液滴均匀浑浊。

阳性血清对照应呈“”反应。阴性血清和抗原缓冲盐水对照应呈“-”反应。

抗原加被检血清出现“”到“”反应为阳性。“++”反应为疑似，“+”到“-”反应为阴性。