牛病毒性腹泻／粘膜病的免疫扩散试验操作技术

---

(一)材料准备

1．抗原：由兽医生物药品厂提供。

2．被检血清：按常规方法采血，分离血清。

3．标准阳性血清：由兽医生物药品厂提供。

(二)操作方法

1．琼脂糖凝胶的制备：按下列配方制备缓冲溶液。

Clycine(氨基乙酸) 29克

Tris(三羟甲基氨基甲烷) 6克

NaN₃(叠氮钠) 0．20克

加蒸馏水至 500毫升

用1molHCl调整pH至8．1，即为离子强度0．04，pH8．1的Tris－Glycine－HCl缓冲液。

称取4．5克琼脂糖，置1，000毫升三角烧瓶中，加入蒸馏水250毫升，放入高压锅内加热至10磅，直到琼脂糖充分融化为止(约15分钟左右)，再加入250毫升在沸水浴中预热的上述缓冲液，充分混匀后，趁热按制板需要的量分装到试管中，凝固后塞上胶塞放4℃备用。琼脂糖的浓度为0．9%，缓冲液的离子强度为0．02。

2．制板：制板时，从冰箱中取出一管凝胶放在沸水浴中充分融化后，立即倒在水平的玻璃板上，凝胶的厚度为2毫米，凝固后放入带盖的保温盒中备用。

3．打孔：按7孔型打孔，中央1孔，周围6孔，用直径为6毫米边缘锐利的金属管打孔，孔距为4毫米，然后用针头或眼科刀将孔中的琼脂块挑去。

4．加样：用微量移液器加样，每孔加50微升，也可以用玻璃滴管加样，但每孔以刚好加满为宜。中央孔加抗原，周围孔间隔加标准阳性血清与被检血清。

5．扩散：加样完毕后，将凝胶板放入湿盒内，置室温下，让其扩散。

(三)结果判定 观察结果时，将凝胶板放在台灯灯光的斜上方(约45度)，对着黑色背景进行观察。扩散后每隔12小时左右判断一次结果，48小时后作最后判读。判定标准如下。

1．抗原和被检血清孔之间出现明显的沉淀线，而且与阳性标准血清的沉淀线完全融合者，判为阳性反应。

2．阳性标准血清的沉淀线向被检血清孔偏移，但不能在抗原孔与被检血清之间形成完整的沉淀线或沉淀线很微弱者，为弱阳性反应。

3．在被查血清孔和抗原孔之间不出现任何沉淀线者，判为阴性。

4．在被检血清孔和抗原孔之间虽然出现沉淀线，但与标准阳性血清的沉淀线不融合，这种沉淀线为非特异沉淀线，仍应判为阴性。

5．若在被检血清孔和抗原孔之间出现两条(或多条)沉淀线，其中只有一条能与标准阳性血清的沉淀线完全融合者，仍应判为阳性。