烟酸的测定

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样品经水解后，烟酸(尼克酸)成游离态，它与溴化氰作用后可与对氨基苯磺酸产生黄色化合物，在一定条件下，色泽深浅与烟酸含量成正比。可在440nm波长处测定光密度。

试剂

(1)硫酸铵。

(2)1N硫酸。

(3)2N盐酸：取16．8毫升浓盐酸(比重1．19)用水定容至100毫升。

(4)氨水：取5毫升浓氨水，用水定容至250毫升。

(5)磷酸盐缓冲溶液(pH8)：称60克磷酸氢二钠，10克磷酸二氢钾溶解后，定容至200毫升。

(6)10%溴化氰溶液：将370毫升水加热至40℃时，加入40克溴化氰结晶，溶解，冷却后定容至400毫升。贮存于冰箱内(在毒气柜内操作)。

(7)10%对氨基苯磺酸；在170毫升水中加入20克对氨基苯磺酸，同时加氨水溶解，每次1毫升，直至全部溶解，用1∶1盐酸调节pH至4．5。以溴甲酚绿为外指示剂。

(8)溴甲酚绿指示剂：称0．1克溴甲酚绿，在研钵中研细，加入2．8毫升0．05N氢氧化钠溶解，以水稀释至200毫升pH4时为绿色，pH5．8时为蓝色。

(9)55%对氨基苯磺酸：加27毫升水和27毫升氨水于55克对氨基苯磺酸中使之溶解，如不溶可加热，调节pH至7，稀释至100毫升，避光保存。

(10)烟酸标准溶液：

贮备液(100克微／毫升)准确称烟酸50毫克(用五氧化二磷干燥过夜，暗室内贮存)，溶于25%乙醇中，定容至500毫升容量瓶中(用25%乙醇定容)存于10℃处。

工作A液(10微克／毫升)：取10毫升贮备液，用水定容至100。毫升

工作B液(4微克／毫升)：取2毫升贮备液，用水稀释并定容至50毫升。

操作步骤

A、非谷类样品：

1．样液的提取

(1)准确称取样品15～20克(要求每毫升含烟酸3～4微克)。置1000毫升锥形瓶中，加入200毫升1N硫酸混匀。

(2)在15磅压力下，加热30分钟，冷却后，用10N氢氧化钠溶液调整至pH4．5(用溴甲酚绿外指示剂)。加水稀释至250毫升，过滤备用。

(3)在50毫升容量瓶中加入17克硫酸铵。用移液管吸取上述过滤样液40毫升，定容至50毫升，剧烈振摇，过滤，此为样品提取液。

(4)取1个50毫升容量瓶，吸取40毫升烟酸标准工作液(每毫升含烟酸4微克)，再加17克硫酸铵，混匀，溶解，定容至50毫升，过滤，此标准液每毫升含烟酸3．2μg。

2．测定

(1)标准对照：于带塞刻度试管中依次加入1．0毫升标准溶液，5．0毫升水，0．5毫升稀氨水、2．0毫升10%对氨基苯磺酸溶液和0．5毫升2N盐酸溶液。

(2)标准溶液：于带塞刻度试管中依次加入1．0毫升标准溶液，0．5毫升稀氨水，5．0毫升溴化氰，2．0毫升10%对氨基苯磺酸溶液和0．5毫升水。

(3)样品溶液对照：于带塞刻度试管中依次加入1．0毫升样品溶液，5．0毫升水，0．5毫升稀氨水，2．0毫升10%对氨基苯磺酸溶液和0．5毫升2N盐酸。

(4)样品溶液：于带塞刻度试管中依次加入1．0毫升样品溶液，0．5毫升稀氨水，5．0毫升溴化氰溶液，2．0毫升10%对氨基苯磺酸溶液和0．5毫升水。

〔注〕测定每1个样品溶液时，均应同时作一对照管。加入试剂时应按次序一管加完后进行比色测定，待比色后再作第二管。每加完一种试剂均应混匀，加完溴化氰半分钟后，再加对氨基苯磺酸，混匀，塞好。

3．比色：在分光光度计440nm波长处，以蒸馏水调零，以测定标准溶液为对照，标准溶液、样品溶液对照以及样品溶液的光密度。反复测定多次，选择最大值，一般测定标准溶液及样品溶液的光密度最大值需要时间较长。

4．计算：非谷类样品的计算。

式中：C_标：所加标准溶液的量(微克)；

E^°_样：样品溶液对照管的光密度；

E_样：样品液管的光密度；

E^°_标：标准液对照管的光密度；

E_标：标准液管的光密度；

B．谷类样品：

1．标准曲线的绘制

(1)准确吸取烟酸工作液(10微克／毫升)0．0，5．0，10．0，15．0，20．0，25．0毫升，置于6只250毫升锥形瓶中，并在每一瓶中加入1．5g氢氧化钙。然后每瓶均加水至90毫升，在15磅压力下高温水解2小时。取出，冷却后加水定容至100毫升。置冰箱中过夜。

(2)从每一容量瓶中吸取上清液50毫升，置离心管中，冰浴15分钟，3000转／分离心15分钟。

(3)从每一离心管吸取上清液20毫升，转入另外离心管中，管内预先放有8克硫酸铵和2毫升磷酸盐缓冲液，摇匀，溶解，加热至55℃～60℃，离心5分钟，过滤，备用。

(4)标准管：分别吸取上述不同浓度的标准抽提液各5毫升，分别移入试管中。置冰浴中30分钟。然后分别加入10毫升冷溴化氰溶液。混匀。30秒钟时再加入1毫升55%对氨基苯磺酸，混匀，再置冰浴中数分钟，取出，于470nm波长测光密度(以试剂空白校正零点)。

(5)标准液对照管：分别吸取上述不同浓度的标准抽提液各10毫升，分别移入试管中。冰浴30分钟，然后各管均加入1毫升55%对氨基苯磺酸，混匀，置冰浴数分钾，于470nm波长测光密度(以试剂空白校正零点)。

(6)标准溶液的光密度读数应各减去其对照管的光密度读数，以不同浓度的标准溶液的光密度为纵坐标，以相应的烟酸微克数为横坐标绘制标准曲线。

2．样品液的测定：准确称样品3～5克(约含100微克烟酸)置250毫升锥形瓶中，瓶内预先加入1．5克氢氧化钙，加水90毫升，在15磅压力下热水解2小时，取出，冷却后加水定容至100毫升容量瓶中，置冰箱中过夜。以下步骤按标准曲线绘制进行，测得样品溶液中的光密度，并从标准曲线查出其含量。但实际测定时，样品溶液的测定可与标准曲线同时进行。

3．谷类样品的计算：

式中：C：样品溶液从标准曲线中查得烟酸量(微克)

W：样品重量(克)。

〔注〕溴化氰有剧毒，操作时应在通风柜中进行。