溶血性链球菌的检验

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1．培养基和试剂

(1)葡萄糖肉浸液肉汤：按本节九 (三)1规定，在肉浸液肉汤中加入1%葡萄糖。

(2)肉浸液肉汤：按本节九 (三)1规定。

(3)匹克氏肉汤：按本节九 (三)18规定。

(4)血琼脂平板：按本节九 (三)2规定。

(5)人血浆。

(6)0．25%氯化钙。

(7)灭菌生理盐水。

(8)杆菌肽药敏纸片(含0．04单位)。

2．检验程序

溶血性链球菌检验程序见图4－2－13。

图4－2－13 溶血性链球菌检验程序

3．操作步骤

(1)样品处理：称取25g固体检样或吸取25mL液体检样，加入225mL灭菌生理盐水，研成匀浆制成混悬液。

(2)一般培养：将上述混悬液吸取5mL，接种于50mL葡萄糖肉浸液肉汤；或直接划线接种于血平板上，如检样污染严重，可同时按上述量接种于匹克氏肉汤，经36℃±1℃培养24h，接种血平板，置36℃±1℃培养24h，挑取乙型溶血圆形突起的细小菌落，在血平板上分纯，然后观察溶血情况及革兰氏染色，并进行链激酶试验及杆菌肽敏感试验。

(3)形态与染色：本菌呈球形或卵圆形，直径0．5～1μm，链状排列，链长短不一，短者4～8个细胞组成，长者20～30个，链的长短常与细菌的种类及生长环境有关；液体培养中易呈长链；在固体培养中常呈短链，不形成芽孢，无鞭毛，不能运动。

(4)培养特性：该菌营养要求较高，在普通培养基上生长不良，在加有血液、血清培养基中生长较好，溶血性链球菌在血清肉汤中生长时管底呈絮状或颗粒状沉淀。血平板上菌落为灰白色，半透明或不透明，表面光滑，有乳光，直径为0．5～0．75mm，为圆形突起的细小菌落，乙型溶血链球菌周围有2～4mm界限分明，无色透明的溶血圈。

(5)链激酶试验：致病性乙型溶血性链球菌能产生链激酶(即溶纤维蛋白酶)，此酶能激活正常人体血液中的血浆蛋白酶原，使成血浆蛋白酶，而后溶解纤维蛋白。

吸取草酸钾人血浆0．2mL，加0．8mL灭菌生理盐水，混匀，再加入18～24h 36℃±1℃培养的链球菌培养物0．5mL及0．25%氯化钙0．25mL(如氯化钙已潮解，可适当加大至0．3%～0．35%)，振荡摇匀，置于36℃±1℃水浴中10min，血浆混合物自行凝固(凝固程度至试管倒置，内容物不流动)，然后观察凝块重新完全溶解的时间，完全溶解为阳性，如24h后不溶解为阴性。

草酸钾人血浆配制：草酸钾0．01g放入灭菌小试管中，再加入5mL人血，混匀，经离心沉淀，吸取上清液即为草酸钾人血浆。

(6)杆菌肽敏感试验：挑取乙型溶血性链球菌液，涂布于血平板上，用灭菌镊子夹取每片含有0．04单位的杆菌肽纸片，放于上述平板上，于36℃±1℃培养18～24h，如有抑菌带出现即为阳性，同时用已知阳性菌株作为对照。