(1)蛋白质通过物理吸附，覆盖在聚苯乙烯表面，其覆盖量取决于蛋白质浓度、pH值、温度、时间及离子强度。高pH值和相对低的离子强度缓冲液，一般有利于蛋白质覆盖在聚苯乙烯表面。覆盖量随蛋白质浓度和覆盖时间增加而增加，在通常应用覆盖的蛋白质浓度下，一般在37℃3小时内达到最大覆盖量。
(2)标记抗体应选最适浓度，在这种浓度下阳性和阴性血清应有明显区别。浓度过高易出现假阳性，浓度过低影响灵敏度。
(3)反应时间 对于抗体测定，抗血清和抗体达到最大反应在25℃需4～5小时，增加温度可缩短反应时间。
(4)非特异性吸附严重影响实验的准确性，用含吐温－20(Tween－20)的PBS或生理盐水洗去或阻断非特异性吸附的蛋白质比较有效。