沙门氏菌的检验

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沙门氏菌属是肠杆菌科中的一大属，约有2000个血清型。由于动物的生前感染或食品受到污染，均可使人发生食物中毒，在世界各地的食物中毒中，沙门氏菌食物中毒常占首位或第二位。

目前，用于食品中沙门氏菌的检验方法，包括五个基本步骤：

(1)前增菌，用无选择性的培养基使处于濒死状态的沙门氏菌恢复其活力；

(2)选择性增菌，使沙门氏菌得以增殖，而大多数的其它细菌受到抑制；

(3)选择性平板分离沙门氏菌；

(4)生化试验，鉴定到属；

(5)血清学分型鉴定。

(一)器材

(1)天平，均质器或研钵。

(2)恒温培养箱，恒温干燥箱，高压灭菌器，显微镜。

(3)灭菌三角瓶(250mL)，灭菌广口瓶(500mL)，灭菌平皿(直径9cm)。

(4)灭菌吸管(10、1mL)、灭菌小试管(内径0．3×5cm)。

(5)载玻片，酒精灯，接种棒，试管架。

(二)培养基

见附：检验沙门氏菌的主要培养基及大肠菌群检验的有关部分。

(三)操作步骤

包括五个步骤：前增菌，选择性增菌，选择性平板分离沙门氏菌，生化试验以及血清学分型鉴定。

1．前增菌、选择性增菌

(1)称取检样25g加入装有225mL缓冲蛋白胨水(BP)的500mL广口瓶内(固体食品应先均质，8000～10000r／min，1min，或用灭菌乳钵研碎)，置(36±1)℃培养4h。

(2)轻轻摇动前增菌数液，取10mL接种于100mL氯化镁孔雀绿(MM)增菌液中或四硫磺钠煌绿(TTB)增菌液中，42℃培养18～24h。另取10mL，加入100mL亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液内，(36±1)℃培养18～24h。

(3)鲜肉等样品不必前增菌，取25g加灭菌生理盐水25mL，按上法做成匀液，取其半量接种MM或TTB增菌液中，42℃培养24h；另取半量接种于SC增菌液中，(36±1)℃培养24h。

2．选择性平板分离沙门氏菌

取增菌液一接种环，划线接种亚硫酸铋琼脂(BS)平板和DHL琼脂平板(或HE平板，SS琼脂平板)各一个，(36±1)℃培养18～24h［BS，(36±1)℃培养40～48h］。观察菌落生长情况。沙门氏菌在选择性平板上的菌落特征见附表Ⅰ。

附表Ⅰ 沙门氏菌属细菌在各种选择性琼脂平板上的菌落特征

3．生化试验

(1)挑取选择性平板上的可疑菌落，接种三糖铁琼脂，为防遗漏，可挑取3～5个菌落，分别接种3～5个试管，(36±1)℃培养18～24h，取出观察，结果见附表Ⅱ。

附表Ⅱ 肠杆菌科各菌属在三糖铁琼脂内反应结果

注：+：阳性，－：阴性，+／－：多数阳性少数阴性。

(2)选取三糖铁琼脂上生长的可疑菌，接种蛋白胨水(供靛基质试验用)，尿素琼脂(pH7．2)，氰化钾培养基和赖氨酸脱羧酶试验培养基及空白对照培养基各一管，(36±1)℃培养18～24h，必要时培养48h，取出观察，结果见附表Ⅲ、附表Ⅳ。

附表Ⅲ 沙门氏菌属生化反应结果

注：①三糖铁琼脂高层产酸。不产酸者可排除沙门氏细菌。斜面产酸与产气与否均不限。

②氰化钾、赖氨酸可选用其中一项，但不能判定结果时，需补做另一项。

③+：阳性，－：阴性，+／－：多数阳性、少数阴性。

附表Ⅳ 尿素、氰化钾和赖氨酸三项中有一项异常，仍判为沙门氏菌，两项异常者，判为非沙门氏菌

注：+：阳性，－：阴性。

4．血清学反应

用沙门氏菌因子血清做平板凝聚试验。即第一步取2～3接种环A－F多价抗O血清于平板上，再取(2)项之菌与血清混合，室温下2～3min之内凝聚者为阳性。第二步取2～3接种环分群(组)抗O血清与待检菌混合，凝聚者为阳性，这时即可确定其群(组)别。根据具体情况，还可使用各单因子“O”血清来测定细菌种的抗原。如有必要再查表取可能的第一及第二相“H”血清与待检菌做鞭毛凝聚试验(操作时先做第一相鞭毛抗原再做第二相鞭毛抗原)，最后确定细菌的抗原式。进行玻片凝聚时，应设对照，即在玻片的另一端，以生理盐水代替血清作凝聚试验，观察有无细菌自凝现象。

判定

(1)若生化试验符合沙门氏菌的生化性状，与沙门氏菌A－F群多价抗O血清凝聚的，判为沙门氏菌属细菌。

(2)生化试验符合沙门氏菌的生化性状，又能与某群“O”血清凝聚，并能用“H”因子血清定型(种)的，可判定为某型(种)沙门氏菌。

附表Ⅴ 在附表Ⅲ中如靛基质阳性，则可做血清凝聚试验，当A－F多价抗O血清又不凝时，补做甘露醇和山梨醇试验

注：+：阳性，－：阴性。

附表Ⅵ 在附表Ⅱ中如H2S阴性，三糖铁斜面产酸者可排除沙门氏细菌；H2S阴性，三糖铁斜面不产酸，可做血清学试验，当A－F多价抗O血清又不凝聚时，应补做下列项目的试验

注：①+：阳性，－：阴性，d：有不同的反应结果。

②判定时，应注意伤寒沙门氏菌鸟氨酸阴性，甲型副伤寒沙门氏菌氨酸阴性，鸡沙门氏菌无动力。

③如果未做氰化钾试验时，常需做V－P试验(22～25℃，4d)哈夫尼亚菌属为阳性。

(3)生化试验不典型或出现了血清学的变异型，则查阅本试验的有关附录进行判定。检验程序如图5－2－3。

图5－2－3 沙门氏菌的检验程序

附：检验沙门氏菌用的主要培养基

1．ONPG培养基

成分：邻硝基酚β－D－半乳糖苷(ONPG)60mg，001mol／L磷酸钠缓冲液(pH7．5)，1%蛋白胨水(pH7．5)。

制法：将ONPG溶于缓冲液内，加入蛋白胨水，过滤除菌，分装于10mm×75mm试管，每管0．5mL，用橡皮塞塞紧。

试验方法：自琼脂斜面上挑取培养物1满接种环，(36±1)℃培养1～3h和24h观察结果，如β－半乳糖苷酶产生，则于1～3h变黄色，如无此酶则24h不变色。

2．氰化钾(KCN)培养基

成分：蛋白胨10g，氯化钠5g，磷酸二氢钾0．225g，磷酸氢二钠5．64g，蒸馏水1000mL，0．5%氰化钾溶液20mL，调pH=7．6。

制法：除KCN外的其它成分配好后，分装烧瓶，121℃灭菌15min，充分冷却后，每100mL培养基加0．5%氰化钾溶液2．0mL，使最后浓度为1∶10000，分装于12mm×100mm灭菌试管，每管约4mL，立刻用橡皮塞塞紧，置4℃冰箱内，至少可保存2个月。同时将不加氰化钾的培养基作为对照培养基，分装试管备用。

试验方法：将琼脂培养物接种于蛋白胨水内成为稀释菌液，挑取1环接种于KCN培养基，另挑取1环接种于对照培养基。(36±1)℃培养1～2d，观察结果。如有细菌生长即为阳性(不抑制)，经2d细菌不生长为阴性(抑制)。

注意：KCN是剧毒药物，使用时应注意，以免中毒。同时试管应严密封口，避免KCN分解，造成假阳性。

3．缓冲蛋白胨水(BP)培养基

成分：蛋白胨10g，氯化钠5g，磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)9g，磷酸二氢钾1．5g，蒸馏水1000mL，调pH=7．2。

制法：按上述成分配好后装于大烧瓶，120℃灭菌15min，临用时无菌分装，每瓶225mL。

4．氯化镁孔雀绿增菌液(MM)

甲液：胰蛋白胨5g，氯化钠8g，磷酸二氢钾1．6g，蒸馏水1000mL。

乙液：氯化镁(化学纯)40g，蒸馏水100mL。

丙液：0．4%孔雀绿水溶液。

制法：分别按上述成分配好后，121℃灭菌15min，备用。临用时取甲液90mL、乙液9mL、丙液0．9mL，以无菌操作混合即可。

5．四硫磺酸钠煌绿增菌液(TTB)

基础培养基：多肽或胨5g，胆盐1g，碳酸钙10g，硫代硫酸钠30g，蒸馏水1000mL。

碘溶液：碘6g，碘化钾5g，蒸馏水20g。

制法：将基础培养基的各个成分加入蒸馏水中，加热溶解，分装，每瓶100mL，分装时应随时振摇，使其中的碳酸钙混匀。121℃灭菌15min，备用。临用时每100mL基础培养基中加入碘溶液2mL、0．1%煌绿液1mL。

6．亚硒酸盐胱氨酸增菌液(SC)

成分：蛋白胨5g，乳糖4g，亚硒酸氢钠4g，磷酸氢二钠5．5g，磷酸二氢钾4．5g，L－胱氨酸0．01g，蒸馏水1000mL。

1%L－胱氨酸－氢氧化钠溶液的配法：称取L－胱氨酸0．1g(或DL－胱氨酸0．2g)，加1mol／L氢氧化钠1．5mL后溶解，再加入蒸馏水8．5mL即成。

制法；将除亚硒酸氢钠和L－胱氨酸以外的各成分溶解于900mL蒸馏水中，加热煮沸，待冷后备用。另将亚硒酸氢钠溶解于100mL蒸馏水中，加热煮沸，俟冷，以无菌操作与上液混合。再加入1%L－胱氨酸－氢氧化钠溶液1mL。分装于灭菌瓶中，每瓶100mL，pH应为7．0±0．1。

7．亚硫酸铋琼脂(BS)

成分：蛋白胨10g，牛肉膏5g，葡萄糖5g，硫酸亚铁0．3g，磷酸氢二钠4g，煌绿0．025g，柠檬酸铋铵2g，亚硫酸钠6g，琼脂18～20g，蒸馏水1000mL，调pH=7．5。

制法：

(1)将前面5种成分溶于300mL蒸馏水中。

(2)将柠檬酸铋铵和亚硫酸钠另用50mL蒸馏水溶解。

(3)将琼脂于600mL蒸馏水中煮沸溶解，冷至80℃。

(4)将以上三液合并，补充蒸馏水至1000mL，校正pH，加0．5%煌绿水溶液5mL，摇匀。冷至50～55℃，倾注平皿。

注：此培养基不需高压，制备过程不宜过分加热，以免降低其选择性，而且应在临用前一天配制，存于室温暗处。超过48h不宜使用。

8．DHL琼脂

成分：蛋白胨20g，牛肉膏3g，乳糖10g，蔗糖10g，去氧胆酸钠1g，硫代硫酸钠2．3g，柠檬酸钠1g，柠檬酸铁铵1g，中性红0．03g，琼脂18～20g，蒸馏水1000mL，调pH=7．3。

制法；将除中性红和琼脂以外的成分溶解于400mL蒸馏水中，校正pH。再将琼脂于600mL蒸馏水中煮沸溶解，两液合并，并加入0．5%中性红水溶液6mL，待冷至50～55℃，倾注平板。

9．HE琼脂

成分：胨12g，牛肉膏3g，乳糖12g，蔗糖12g，水杨素2g，胆盐20g，氯化钠5g，琼脂18～20g，蒸馏水1000mL，0．4%溴麝香草酚蓝溶液16mL，Andrade指示剂20mL，甲液20mL，乙液20mL，调pH=7．5。

制法：将前面7种成分溶解于400mL蒸馏水中作为基础液；将琼脂加入600mL蒸馏水内，加热溶解。加入甲液和乙液于基础液内，校正pH。再加入指示剂，并与琼脂混合，待冷至50～55℃，倾注平板。

注：

(1)此培养基不可经高压。

(2)甲液的配制：硫代硫酸钠34g，柠檬酸铁铵4g，蒸馏水100mL。

(3)乙液的配制：去氧胆酸钠10g，蒸馏水100mL。

(4)Andrade指示剂：酸性复红0．5g，1mol／L氢氧化钠溶液16mL，蒸馏水100mL。将复红溶于蒸馏水中，加入氢氧化钠溶液。数小时后如复红褪色不全，再加氢氧化钠溶液1～2mL。

10．SS琼脂

基础培养基：牛肉膏5g，胨5g，三号胆盐3．5g，琼脂17g，蒸馏水1000mL。

将牛肉膏、胨和胆盐溶解于400mL蒸馏水中，将琼脂加入600mL蒸馏水中，煮沸使其溶解，再将二液混合，121℃灭菌15min，保存备用。

完全培养基：基础培养基1000mL，乳糖10g，柠檬酸钠8．5g，硫代硫酸钠8．5g，10%柠檬酸铁溶液10mL，1%中性红溶液2．5mL，1%煌绿溶液0．33mL。

加热溶化基础培养基，按比例加入上述染料以外的各成分，充分混合均匀，校正pH=7．0，加入中性红和煌绿溶液，倾注平板。

注：

(1)制好的培养基宜当天使用，或保存于冰箱内48h内使用。

(2)煌绿溶液配好后应于10d内使用。

(3)可用SS琼脂的干燥培养基，按说明配制使用。

11．三糖铁琼脂(TSI)

成分：蛋白胨20g，牛肉膏5g，乳糖10g，蔗糖10g，葡萄糖1g，氯化钠5g，硫酸亚铁铵［Fe(。NH₄)₂(SO₄)₂·6H₂O］0．2g，硫化硫酸钠0．2g，琼脂12g，酚红0．025g，蒸馏水1000mL，调pH=7．4。

制法：将除琼脂和酚红以外的各成分溶解于蒸馏水中，校正pH。加入琼脂，加热煮沸以溶化琼脂。加入0．2%酚红水溶液12．5mL，摇匀。分装试管，装量宜多些，以便得到较高的底层。121℃灭菌15min，放置高层斜面备用。