氨基态氮的测定(茚三酮-酚-吡啶比色法)

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本法利用氨基酸与茚三酮溶液一起共热而生成蓝紫色的有色物质的特性进行氨基态氮的测定。此蓝紫色有色物质是氨基酸被茚三酮氧化而游离出氨，此氨与一分子茚三酮及一分子茚三酮的还原产物(茚三酮氧化氨基酸时产生)缩合而成。

(一)试剂配制

1．5%茚三酮溶液 1g茚三酮溶解在200ml无水乙醇中。

2．80%酚溶液 80g酚溶解在20ml无水酒精中(稍加热)，再加1m1人造沸石，大约摇动20min，以除去微量的氨，然后将溶液轻轻倒入试剂瓶中，备用。

3．氰化钾吡啶溶液 将2m1 0．01mol氰化钾溶液用已准备好的无氨吡啶稀释至100ml(100m1吡啶加1mg人造沸石)摇动20min。

4．60%酒精(体积比)。

5．80%酒精(体积比)。

所有试剂在室温下至少可以稳定一个月，但酚溶液易吸收空气中的氨，因此每周需加入人造沸石摇动。

6．氨基酸标准液 称取在盛有浓硫酸的真空干燥器中干燥48h的亮氨酸0．5622g，溶于少量0．1N盐酸溶液后，继用0．1N盐酸将溶液转入100m1容量瓶中并定容至刻度。此为含氨基态氮600μg／m1的母液。吸此母液1m1用0．1N盐酸在100m1容量瓶中定容。此为含氨基态氮6μg／ml的标准液，放入冰箱中保存。

(二)测定步骤 称取0．2000g通过0．42mm孔径的植株干样，置50ml+烧杯中，加入25ml 80%的乙醇，置80℃水浴上提取约20min(经常搅动)提取后用滤纸过滤入50m1容量瓶中，并用80%乙醇反复净洗残渣，最后定容，摇匀待测。

吸取0．5ml待测液于10m1容量瓶中，同时吸取氨基酸标准液(6μg／m1氨基态氮)0，0．08，0．17，0．25，0．34，0．42，0．5m1也分别移于10ml容量瓶中，各加入1m1氰化钾吡啶溶液，1m180%酚溶液，摇匀后，放入沸水浴中煮沸10min，加入0．2ml5%茚三酮溶液，摇匀加小漏斗或球形盖，再煮沸5min后取出冷却，再用60%乙醇溶液稀释至刻度。摇匀后在570nm波长下用分光光度计比色，读取吸光度，并以氨基态氮系列标准液的吸光度为纵坐标，相应的系列标准液中含氨基氮的微克数为横坐标绘制工作曲线(系列标准液中含氨基态氮分别为：0，0．48，1．02，1．50，2．04，2．52，3．00μg)。

(三)结果计算

式中：比色得微克数——为待测液吸光度在工作曲线上所查得的相应氨基态氮的微克数；

W——样重(g)。