方法

---

在阐明分生组织、茎尖和芽培养的全部程序时，拟提供草本植物(马铃薯)的分生组织和木本植物茎尖培养方法。由于不同植物种，同一植物种的不同发育时期以及同一植物不同部位似乎有不同的培养要求，读者可参考下节为了改进其他实验植物材料茎尖培养程序的影响成功培养的不同因素。

(一)草本植物——马铃薯的分生组织培养(图4-1)

图4-1 用分生组织培养生产无病毒马铃薯的图解

1．外植体来源 2．初始培养的分生组织外植体 3．外植体生长 4．腋生枝增殖 5a．移植 5b．块茎形成

1．获得植物材料

①把块茎切成20g重的切块。

②切块浸入0．03mM GA溶液1h，以打破芽的休眠。

③切块在培养室无菌潮湿的蛭石里发芽。

④当芽长至3—5cm长时，切取茎尖。

2．材料表面不需消毒

3．分割

①在15—20倍解剖镜下观察，为由薄片组成的帽状结构。

②分割具有叶原基的半球形分生组织(大约75μM)。

4．阶段I起始培养

①各个分生组织外植体转移到附加1g／l Bactotryptone的MS固体培养基上，培养管为15×19mm。

②在25℃、12h光周期下培养，第一个月光照强度150lx，第二个月500lx，光源是由白色荧光灯和白炽灯的混合光。

③二个月再生了3cm高的生根小植株。

5．阶段Ⅱ在试管内压条生根繁殖

①再生小苗平放在附加0．005μM NAA的MS固体培养表面，培养瓶为250ml。

②在20天内逐渐长出2—3个腋生枝和不定根。

③把新近长出的腋生枝按压在琼脂表面呈水平状态。

④20天为一个周期，这样反复进行，直到形成大量腋生枝为止。

⑤用无菌手术剪分割腋生枝，并转移至新的培养基上再培养。

⑥20天为一个周期，又这样反复进行分割，再培养。具有2—3倍的增殖能力．

6．离体培养中块茎的形成

①切割的腋生枝转移到含有22．0—44．0μM BA和0．23M蔗糖的MS培养基上，用300或500ml的培养瓶。

②培养温度18—20℃，8h光照，强度100—500lx。

③四个月的时间，从一个500ml的培养瓶里能获得30—50个休眠小块茎。

(二)木本植物——美洲擦木茎尖培养(图4-2)

图4-2 美洲擦木苗尖培养图解

1．5—6龄野外生长树木芽外植体 2．初级培养 3．腋生枝增殖 4．在液体培养基中长根，滤纸桥系统 5．长根幼苗 6．移植

1．获得外植体

①在早期有叶小枝中，用抗生素和内吸性杀真菌剂混合物(链霉素0．1%+Benlate0．1%)处理5年生树的带芽小枝条一个星期。

②取一周后的第四小枝新近发芽枝条(约5cm长)。

③分割8—10mm长，具半球形生长点和十七个包紧的叶原基的茎尖。

2．表面消毒

①浸入75%的酒精中2—3s。

②用无菌蒸馏水冲洗一次。

③浸在0．5%NaClO₃和0．01%吐温20混合溶液中，超声振动5min。

3．阶段I——起始培养 茎尖转移到修改的LS固体培养基上，该培养基具有二倍的FeEDTA和以下附加物：0．15M蔗糖、3%CW、100mg／l麦芽汁，0．22mM ADE硫酸盐、0．34mM谷酰胺、0．3mM精氨酸、0．27μ．M NAA和0．28mM KIN。

4．阶段Ⅱ——腋生枝的增殖

①芽丛转到培养基成分相同的新配制的培养基上培养，培养瓶250rnl。

②每月一次，重复进行培养。

③为了促进枝条生长，将芽丛转移至培养基成分相同的新鲜培养基上培养，只是培养基中KIN的量减少到23．0μM。

5．阶段Ⅲ——长根

①将1cm长的枝条转移到补充有25．0μM IBA的LS液体培养基的试管内，漏纸法培养。

②在15—45天内偶尔产生一些根(20%)。

6．移植

①把长根幼小植株移入装有蛭石的盘中，用透明塑料膜覆盖。

②放在白天25℃和晚上15℃的12h4k lx白色荧光下培养。

③在移植后一个月移栽大田，成活率达95%。

【参考文献】：

〔1〕Andesson，W．C．1980 Mass propagation by tissue culture： prineiples and practics．In： Preceedings Conference on Nursery Production of Fruit Plants Through Tissue Culture-Applications and Feasibility SEA，Agri．Res．Results，N．E．Series No．11，pp．1-1 USDA Beltsville．

〔2〕Kartha，K．K．1981 Meristem culture and cryopreservation-methods and application In： Plant Tissue Culture(T．A．Thorpe ed．)pp．181-211．

〔3〕Murashige，T．1974 Plant propagation through tissue cultures．Annu．Rev．Plant physiol．25∶135-166．

〔4〕Wang，P．J and Hu，C．Y．1980 Regeneration of virus-free plants through in vitro culture．In： Adyances in Biochemieal Enginn ering，Vol．18，Plant Cell Cultures I(A．Fiechter， edpp．61-99．Springer-verlag，Berlin，Heidelberg，New York．