微量凯氏定氮——茚三酮法

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蛋白质经消化后，蛋白氮呈(NH₄)₂SO₄状态存在，用茚三酮法比色测定含氮量，以蛋白质中平均含量16%计算，即乘以换算系数6．25即可求出蛋白质的含量。

试剂

(1)10N H₂SO₄溶液：取浓H₂SO₄8．3毫升，加入21．7毫升蒸馏水中。

(2)50%醋酸溶液。

(3)30%H₂O₂溶液。

(4)4M的醋酸盐缓冲液，pH5．5：4M醋酸钠溶液与4M醋酸溶液按443∶57．5的比例混合。

(5)茚三酮试剂：2克茚三酮溶解于50毫升乙二醇甲醚，25毫升4M醋酸盐缓冲液(pH5．5)，25毫升蒸馏水，再加0．08克Sncl₂·2H₂O(检查pH必须达到5．5)。

(6)(NH₄)₂SO₄标准液：(NH₄)₂SO₄(A、R、)烘至恒重。精确称取50毫克，加水定容至100毫升，得浓度为0．5毫克／毫升。用时稀释10倍，得50微克／毫升。

(7)蛋白质样品溶液：含蛋白质0．2～1．0毫克／毫升范围内。

操作步骤

1．消化：取样品液0．4毫升，置于微量凯氏定氮消化瓶中，加0．5毫升10NH₂SO₄进行消化约半小时，稍冷后滴加30%H₂O₂数滴，继续消化至溶液透明。冷却后加蒸馏水4毫升(总体积按5毫升计)。

2．茚三酮反应：取上述消化液0．2毫升及0．4毫升于试管中，分别加pH5．5醋酸缓冲液至2．0毫升(空白管加2．0毫升同样缓冲液)。加茚三酮试剂2毫升，混匀，沸水浴中煮沸30分钟，冷却后加50%乙醇6毫升。于570毫微米波长读取光密度。

3．标准曲线制作：在试剂中分别加50微克／毫升(NH₄)₂SO₄液0，0．1，0．2，0．3，0．4，0．5毫升，分别加pH5．5醋酸盐缓冲液至2毫升，按上述第二步同样步骤加入茚三酮试剂等，于570毫微米波长读取光密度。

4．计算：

(1)绘制标准曲线：以(NH₄)₂SO₄相当的微克氮量为横坐标。OD₅₇₀为纵坐标作图。

(2)由样品OD₅₇₀值从标准曲线上查出相当微克氮含量。

式中：V为用茚三酮反应的消化液毫升数。