此法适用于测定数种试验菌对一种药物的敏感性比较试验。
一、培养基和菌液准备同滤纸片扩散法
二、试验方法
1．以无菌小刀，在平板培养基的中部，切一宽约7mm的纵沟，并挖出沟中琼脂弃去。再用无菌滴管吸取热琼脂封固沟底两侧，使琼脂与平皿底部严密相接，以免加入药液流至琼脂下部(也可用含有一定剂量药液的滤纸条代替小沟)。
2．分别用浸有不同试验菌的棉拭，于沟边垂直接种各种试验菌。待稍干后，以无菌滴管吸取药液，加入沟中，勿使其外溢。置37℃培养8～18h后观察结果。
3．培养后，根据沟边所生长的试验菌离沟边的抑菌距离来判断药物对试验菌的敏感度。