呼吸酶类试验及其他试验

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一、氧化酶(细胞色素氧化酶)试验

(一)试剂

1．1%盐酸二甲基对苯二胺(或盐酸四甲基对苯二胺)水溶液(于棕色瓶中在冰箱中贮存)。

2．1%α-萘酚酒精(95%)溶液。

(二)试验方法

1．取一张白色滤纸条，滴上1%盐酸二甲基对苯二胺水溶液，以湿润为宜。用细玻棒(或牙签)沾取幼龄试验菌，涂抹在滤纸条上，10s内出现红色者为氧化酶试验阳性。

2．用1%盐酸二甲基对苯二胺液湿润滤纸条后，再加等量的1%α-萘酚酒精溶液，然后再涂抹试验菌，10s内出现蓝色者为阳性。

3．取质量较好的滤纸，先剪成约1cm宽的滤纸条，浸泡在1%盐酸二甲基对苯二胺试剂中(或加等量的1%α-萘酚酒精溶液)，在室温下风干，放在带橡皮塞的大试管中，置冰箱中保存数月。使用方法同上。

(三)注意事项

1．1%盐酸二甲基对苯二胺溶液容易氧化，应保存在棕色瓶中，贮存于4℃冰箱，若溶液变红褐色，不宜使用。

2．本试验避免含铁物质，遇铁物质催化盐酸二甲基对苯二胺呈红色反应，造成假阳性，故用细玻棒(或牙签)挑取试验菌。

3．在滤纸条上滴加试剂，以刚刚打湿滤纸条为宜，如滤纸过湿，会妨碍空气与试验菌接触，而延长了反应时间，造成假阴性。

(四)原理 氧化酶即细胞色素氧化酶在有分子氧和细胞色素C存在时，可氧化盐酸二甲基对苯二胺产生红色反应。若加等量α-萘酚酒精溶液，则形成吲哚酚蓝，出现蓝色反应。

二、过氧化氢酶(触酶)试验

(一)试剂 3%过氧化氢(H₂O₂)溶液，临用时配制。

(二)试验方法

1．取干净的载玻片，在上面滴一滴3%过氧化氢溶液，挑取一环斜面培养的试验菌，在过氧化氢溶液中混匀，若有气泡出现则为过氧化氢酶试验阳性；无气泡产生者为阴性。

2．取2ml3%过氧化氢溶液加入干净的小试管中，用细玻棒沾取试验菌，插入过氧化氢液面下，若有气泡产生者为阳性。

(三)原理 有些细菌具有触酶，能催化过氧化氢分解成水和氧。

(四)注意事项 因为过氧化氢酶是以正铁血红素作为辅基的酶，所以试验菌不应培养在含有血液的培养基上生长，因为这种培养基上生长的细菌易产生假阳性反应。

三、氰化钾抑菌试验

(一)培养基

蛋白胨 10g

氯化钠 5g

磷酸二氢钾(KH₂PO₄) 0．225g

磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·2H₂O) 5．64g

蒸馏水 1000ml

1．混合溶解，调pH为7．6。

2．分装每瓶100ml，121℃20min灭菌。

3．用无菌蒸馏水配制0．5%氰化钾水溶液。

4．每100ml培养基加入0．5%氰化钾1．5ml，充分混匀后，分装无菌试管，每管4ml，并换上无菌橡胶塞塞紧，干4℃冰箱可保存二周。

5．同样的培养基不加氰化钾作空白对照培养基，按同法分装。

(二)试验方法 取幼龄试验菌接种于氰化钾培养基和空白对照培养基，置37℃培养24～48h，观察生长情况。

1．试验菌能在氰化钾培养基上生长，表示氰化钾对试验菌无毒性作用，为阳性。

2．试验菌在氰化钾培养基和空白培养基上均不生长，表示空白培养基不适于试验菌的生长，必须选用合适的培养基。

3．若试验菌在空白培养基上生长，在氰化钾培养基上不生长，为阴性。

注意：氰化钾是剧毒药品，操作时必须非常小心。培养基用完后，每管加几粒硫酸亚铁和0．5ml20%氢氧化钾溶液以去毒，然后才可清洗。

四、硝酸盐还原试验

(一)培养基

1．营养肉汤液 100ml

硝酸钾(KNO₃) 0．1g

调pH为7．2～7．4，分装试管，121℃20min灭菌。

2．蛋白胨 2g

硝酸钾(KNO₃) 0．1g

磷酸氢二钠(Na₂HPO₄) 0．2g

葡萄糖 0．1g

蒸馏水 100ml

以上各成分加热溶解后，调pH为7．2～7．4，分装试管，115℃20min灭菌。

可根据不同试验菌生长的要求，选用其中一种培养基。

(二)试剂

1．甲液：对氨基苯磺酸 0．5g

5mol／L醋酸 100ml

乙液：α-萘胺 0．5g

5mol／L醋酸 100ml

2．二苯胺试剂 二苯胺0．5g溶于100ml浓硫酸中，用20ml蒸馏水稀释。

(三)试验方法 试验菌接种于硝酸盐培养液中，同时设不接种的对照管，于37℃培养3～4天。用两支干净小试管，每天取培养液少许放入试管中，再各滴一滴甲液和乙液，对照管同样加试剂。若试验管菌液呈现红色、橙色者为阳性反应；如无红色出现，则可加一二滴二苯胺试剂。若呈现蓝色反应，则表示培养基中有硝酸盐存在；如不呈蓝色反应，表示硝酸盐和形成的亚硝酸盐已被还原成其他物质，仍应按硝酸盐还原试验阳性反应。

五、溶血试验

(一)试验方法

1．平板法 试验菌接种于血液琼脂平板上，于37℃培养24h后观察，凡在菌落周围出现透明的溶血环者为阳性反应。

2．试管法 取幼龄试验菌16～18h肉汤培养物3ml，与等量的经过生理盐水洗涤3次的绵羊红细胞悬浮液混合，置37℃水浴中30min观察，凡出现溶血者为阳性。

(二)原理 某些细菌在代谢过程中产生溶血素，使人或动物的红细胞发生溶解，以此可鉴别细菌。

六、卵磷脂酶试验

(一)培养基

1．取新鲜鸡蛋，冲洗干净，浸泡在75%酒精15～20min，用无菌纱布擦干。无菌操作打开蛋壳，将蛋黄和蛋白分开，蛋黄盛于含有无菌玻璃珠的三角烧瓶中，加入等量的灭菌生理盐水，用力振摇，制成卵黄悬液。

2．取10ml卵黄液加到已熔化、又冷却到50℃的200ml营养琼脂中，倾注平板，过夜后使用。

或取5ml卵黄液加入灭菌的100ml营养肉汤中，混匀分装无菌试管，制卵黄液肉汤管。

(二)试验方法

1．试验菌点种在卵黄琼脂平板上，每皿可点种3～4株菌。37℃培养24～48h观察，如在菌落周围形成乳白色混浊环者为阳性反应。若试验菌为厌氧菌，则需要在点种上面加盖无菌玻片或进行厌氧培养。

(三)原理 某些细菌产生卵磷脂酶，分解卵黄中的卵磷脂生成脂肪和水溶性的磷脂胆碱，使卵黄发生浑浊现象。

七、磷酸酶试验

(一)培养基

营养琼脂(pH7．2～7．4) 100ml

1%磷酸酚酞溶液 1ml

营养琼脂溶化并冷却至50℃，再加无菌的磷酸酚酞溶液1ml混匀后，倾注平板。

(二)试验方法 将试验菌接种在上述培养基上，37℃培养24h后，打开平板，使培养基表面向下，用浓氨水熏，菌落变为粉红色者为阳性。

八、血浆凝固酶试验

(一)玻片法 玻片一端用腊笔划一直径约1．5cm的圆圈，加生理盐水一滴，挑取菌落浮悬于盐水中，混和均匀，使浑浊似乳，后滴加兔(或人)血浆一滴，充分混匀近一分钟；玻片另一端以血浆和盐水作对照。有细菌的血浆出现凝块而对照无，为凝固酶阳性；二者均无凝块者为阴性。

血浆制备：取无菌兔血(或人血)立即与五分之一的抗凝剂(0．1%肝素或5%柠檬酸钠)混匀，以1500～3000r／min离心15min，取上液(下为红细胞等)即为血浆，以新鲜制备为宜。保存于冰箱中的，要经过试验有效才用。

(二)试管法 将新鲜的兔或人血浆用生理盐水作1∶4稀释，取0．5ml置于小试管中，挑取几个培养24h的菌落混悬于内使成浓厚的悬液，并用已知阳性菌作对照，共置37℃水浴中4～6h，每半小时观察一次，全部或部分凝固者为阳性。

九、链激酶试验

(一)试剂

1．健康兔血浆。

2．0．25%氯化钙水溶液。

(二)试验方法

1．取1支盛有0．8ml无菌生理盐水的小试管，加入健康兔血浆0．2ml。

2．加入试验菌0．5ml(18～24h的肉汤培养物)混合后，再加入0．25%氯化钙水溶液0．25ml。

3．置37℃水浴中观察结果。10min内，血浆先凝固，然后又开始溶解，20min内，凝固的血浆完全溶解者为阳性。若无变化，应在水浴中继续观察，24h凝块仍不溶解者为阴性。

十、耐盐性试验

(一)培养基

肉汤基础液 100ml

根据鉴定需要配制含有不同浓度氯化钠的肉汤管如浓度为2%、3．5%、4%、5%、7%、10%等。培养基要求十分澄清，分装试管，121℃20min灭菌。

(二)试验方法 将幼龄试验菌液接种后，适温培养3～7天。设未接种的对照管对比，观察细菌生长情况。

(三)原理 本试验可测定不同浓度的氯化钠对细菌生长的影响。

十一、亚碲酸盐试验

(一)培养基

3%营养琼脂 100ml

1%亚碲酸钾水溶液 2ml(过滤除菌)

0．5%胱氨酸水溶液 2ml(过滤除菌)

脱纤兔血(或羊血) 10ml

加热溶化营养琼脂，待冷至50℃左右，加入已灭菌的亚碲酸钾、胱氨酸及脱纤血液，立即混匀，倾注平板，凝固后备用。

(二)试验方法 取试验菌接种于培养基上，于37℃培养24～48h后，若能还原亚碲酸钾为金属碲，则菌落呈黑色或灰黑色。

十二、吐温(Tween)80水解试验

(一)培养基

1／15mol／L磷酸盐缓冲液(pH7．0) 100ml

Tween80 0．5ml

0．2%中性红水溶液 2ml

混匀后，分装试管，121℃20min灭菌。培养液呈琥珀色。置暗处保存，在二周内使用。

(二)试验方法 取固体培养基上的试验菌，接种于上述培养基，37℃培养。于第5天、第10天观察，其颜色从琥珀色变为桃红色或红色者为阳性，不变色者为阴性。

(三)原理 有些分枝杆菌能水解Tween80，释放出改变指示剂颜色的脂肪酸。

十三、DNA分解试验

(一)培养基

胰酪蛋白胨 1．5g

氯化钠 0．5g

琼脂 1．5g

0．5%甲基绿(经氯仿抽出) 1ml

0．2mol／L Tris pH7．0 100ml

各成分混合后，经121℃20min灭菌，取出冷却至50℃左右，加入DNA(1．0g溶于无菌蒸馏水100ml)10ml倾注平板。

(二)试验方法 将试验菌点接到平板培养基上，37℃培养过夜。在菌落周围绿色质地上产生一个无色透明环者为阳性。

(三)原理 有些革蓝氏阳性细菌，产生DNA酶，分解培养基中的DNA，在菌落周围出现清晰的透明环。

十四、凝固血清液化试验

(一)培养基

1%葡萄糖肉汤(pH7．6) 1份

无菌采取兔(或牛、羊)血清 3份

将肉汤与血清按比例混合，分装无菌试管，每管约5ml，在血清凝固器内或流通蒸气灭菌器内摆成斜面，经80～85℃间歇灭菌3天。

(二)试验方法 将试验菌接种上述培养基上，37℃培养1～2天，观察凝固血清液化能力。

十五、纤维素分解(cellulose digestion)试验

(一)培养基

胰蛋白胨液(培养基34，省去琼脂)

灭菌滤纸条

(二)试验方法 将试验菌接种于上述培养基中，并加入灭菌滤纸条一条，适温培养10天，若分解纤维素，则滤纸条有缺损、断裂或溶解现象。

十六、溶解死菌试验

试验方法如下。

1．用50ml生理盐水分数次洗下试验菌平板上的菌落，内加2%琼脂，经121℃20min灭菌，制成平板。

2．将待检菌接种于上述培养基上，适温培养，观察菌落周围有无溶菌区。

十七、黄嘌呤分解试验

见嗜皮菌属。

十八、染料抑菌试验

见布氏杆菌属。

十九、多聚β-羟丁酸盐聚积试验

见摩拉氏菌属。

二十、中性红试验

见分支杆菌属。

二十一、烟酸试验

见分支杆菌属。