动物细胞内核酸含量的测定(DNA和RNA的测定)

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将饲养动物组织细胞破碎，从脂质、蛋白质等物质中将核酸分离出来，再利用DNA和RNA的水解特性不同而使二者分开。

本实验分离核酸的方法采用“STS”法。用紫外吸收法测定RNA和DNA含量。

试剂和仪器

(1)20%三氯醋酸(TCA)：称取分析纯三氯醋酸100g，加蒸馏水至500毫升。

(2)10%三氯醋酸(TCA)：将20%三氯醋酸稀释1倍。

(3)5%高氯酸(PCA)：吸取分析纯70%高氯酸(HClO₄)7．1毫升，加蒸馏水92．9毫升。

(4)无水乙醇。

(5)氯仿－甲醇溶液：氯仿∶甲醇=2∶1(v／v)。

(6)乙醚。

(7)0．3N氢氧化钾。

(8)0．1N盐酸。

(9)6N盐酸。

(10)玻璃匀浆器。

(11)冰冻离心机。

(12)751G紫外分光光度计。

(13)离心管等玻璃仪器。

操作步骤

1．组织匀浆和酸溶性杂质的去除，将动物立即处死，取其肝脏，置已冰浴的小烧杯中。剪碎，称取1克碎肝组织，放入玻璃匀浆器中，加入已预冷的蒸馏水5毫升，研磨成浆。再加5毫升预冷的20%TCA溶液，搅匀并转移到离心管内，于℃～4℃、3000转／分，离心20分钟，上清液必须澄清，弃去。沉淀物加10毫升预冷的10%TCA溶液，搅匀，0～4℃，3000转／分，离心20分钟，上清液澄清，弃去。

2．脂质的去除

(1)沉淀物加预冷蒸馏水1毫升，搅成糊状。用滴管缓慢加入10毫升冷的无水乙醇，成均匀悬浊液，0～4℃于3000转／分离心10分钟，弃去上清液。再加入10毫升预冷无水乙醇，成均匀悬浊液，℃～4℃，3000转／分离心10分钟，弃去上清液。

以上操作均在0～4℃进行。以后操作可在室温下进行。

(2)向沉淀物中加10毫升氯仿∶甲醇(2∶1，v／v)溶液，使成均匀悬浊液，3000转／分离心10分钟，弃上层液。此步重复进行一次。

(3)沉淀物中缓慢加入10毫升乙醚，使成均匀悬浊液，3000转／分离心10分钟，弃上层液。此步重复一次。

(4)把具沉淀物的离心管，置于30℃～40℃水浴中，充分除去沉淀物中的乙醚，最后得淡黄色核酸粉末(尚残存部分蛋白质)。

3．RNA的分离：向核酸沉淀物中(淡黄色粉末)加入0．3N氢氧化钾溶液10毫升，将沉淀物搅碎成糊状(必要时要在玻璃匀浆器中，匀浆成糊状)。37℃水浴保温18小时。此时沉淀物中的RNA已水解成核苷酸。碱水解后，加6N盐酸1．65毫升，充分搅拌冷却，于3000转／分离心15分钟，上清液即是已水解成核苷酸的RNA部分。沉淀物中含有DNA和蛋白质。将沉淀再悬浮于0．1N盐酸8．35毫升中，离心分离。合并上述二步所得上清液，并以0．1N盐酸定容至20毫升，此为1克鲜组织中的RNA部分，置冰箱备用。

4．DNA的分离：将提取出RNA的沉淀物，悬浮于20毫升5%高氯酸溶液中，95℃水浴保温15分钟后，于3000转／分离心15分钟，取上清液并定容到20毫升即是1克新鲜组织中已降解的DNA部分。置冰箱备用。

5．紫外吸收法测定RNA和DNA含量

(1)RNA含量的测定，吸取RNA提取液0．5毫升于试管中，加5%高氯酸9．5毫升，混匀。沸水浴中水解15分钟，冷却后以5%高氯酸为空白在751型紫外分光光度计上于260nm波长处，测其O．D₂₆₀值(即光密度值)。

(2)DNA含量的测定：

吸取DNA提取液1毫升，加5%高氯酸4毫升，以5%高氯酸为空白，在751型紫外分光光度计上于260nm波长处，测其光密度值。

(3)计算

DNA或RNA溶液测得的结果以每毫升10微克核酸O．D₂₆₀=0．286进行计算，即：

(0．286是通常从STS法得到的核酸部分所选用的消光系数)。

式中：O．D₂₆₀：测定溶液在260nm处的光密度值；

10：为测定溶液共10毫升；

；为每毫升1微克核酸在260nm处的光密度值：

W：样品重(克)：

1000：换算微克为毫克；

100：换算为百分含量；

20：提取液总体积(毫升)。

式中：O．D₂₆₀：测定溶液在260nm处的光密度值。

：为每毫升1微克核酸在260nm处的光密度值。

5：测定溶液共5毫升。

1：为测定时用0．5毫升DNA原液。

20：提取液总体积(毫升)。

W：样品重(克)。

1000：换算微克为毫克。

100：换算为百分含量。