α－淀粉酶和β－淀粉酶活性的测定

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α－淀粉酶和β－淀粉酶可催化淀粉水解为麦芽糖，麦芽糖能还原3，5－二硝基水杨酸成硝基氨水杨酸有色基团，其颜色深浅与糖的浓度成正比。从而求得麦芽糖含量，以水解生成麦芽糖的毫克数表示总淀粉酶活性的大小。

α－淀粉酶不耐酸，在pH3．6以下钝化，利用这一性质。将酶提取液用pH3．6的醋酸处理，钝化α－淀粉酶，即可求出β－淀粉酶活性。

β－淀粉酶不耐热，将酶提取液加热到70℃15分钟，可以钝化β－淀粉酶，便可测定α－淀粉酶活性。

试剂

(1)0．2M磷酸盐缓冲液(pH5．8)：吸取0．2M磷酸氢二钠80毫升，再吸取0．2M磷酸二氢钠920毫升，二种溶液混合后即成。

(2)1%淀粉溶液：称取1．0克可溶性淀粉加入100毫升蒸馏水煮沸后即成。临用前配制。

(3)0．4N氢氧化钠溶液。

(4)3，5－二硝基水杨酸：准确称取10克3，5－二硝基水杨酸、20克氢氧化钠、200克酒石酸钾钠，加入500毫升蒸馏水，适当加热溶解后，加入2g酚，0．5g无水亚硫酸钠，以蒸馏水稀释至1000毫升，贮于棕色瓶中。

(5)麦芽糖标准液：称取分析纯麦芽糖0．01000克溶于蒸馏水中，定容至100毫升，即为1mg／毫升麦芽糖标准液。

操作步骤

1．酶液的制备：称取样品1～2g置匀浆器中，加入5～10毫升0．2MpH5．8的磷酸盐缓冲液匀浆成浆状，以5毫升缓冲液转移到50毫升容量瓶中，用蒸馏水冲洗匀浆器，合并于容量瓶中，稀释至刻度。在室温下放置20分钟，并不时振摇。以1000转／分离心5分钟，上清液即为酶提取液。

2．麦芽糖标准曲线的制备：吸取麦芽糖标准液0．0，1．0，2．0，3．0，4．0，5．0，6．0，8．0毫升置25毫升刻度试管中，用蒸馏水补齐至8毫升，再加3，5－二硝基水杨酸试剂2毫升，置沸水浴中准确煮沸5分钟，取出冷却，以蒸馏水稀释至25毫升在721型分光光度计于550nm波长处，以对照管为空白，测其光密度。

以光密度为纵坐标，相应麦芽糖含量为横坐标，绘制标准曲线。

3．α－淀粉酶及β－淀粉酶总活性的测定，

(1)吸取酶液1．0～4．0毫升于50毫升容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，混匀，备用。

(2)取对照管及测定管各1支，二管分别加入以上稀释酶液1毫升，再加入1毫升pH5．8磷酸盐缓冲液。

(3)向对照管中加入4毫升0．4N、NaOH溶液，以钝化酶活性，再加入1%淀粉溶液2毫升。

(4)将测定管置40℃(±0．5℃)恒温水浴中保温10分钟，再加入40℃下预热的1%淀粉溶液2毫升，摇匀，立即置40℃水浴中准确保温5分钟后，取出并迅速加入4毫升0，4NNaOH溶液，以终止酶活性。

(5)酶作用后的测定管溶液和对照管溶液，均加入2毫升3，5－二硝基水杨酸试剂，混匀。置沸水浴中准确煮沸5分钟，取出冷却，以蒸馏水稀释至25毫升，在721型分光光度计以550nm波长处，测定其光密度(以试剂空白为对照)。查标准曲线得相应的麦芽糖量。

4．α－淀粉酶活性的测定

(1)取刻度试管2支，标以测定管及对照管，于各管中分别加入酶液1毫升，置70℃(±5℃)恒温水浴中准确加热15分钟，使β－淀粉酶钝化，取出后迅速于流水中冷却。

(2)各管均加入1毫升pH5．8磷酸盐缓冲液。

(3)向对照管中加4毫升、0．4N、NaOH溶液，以钝化酶活性，再加入1%淀粉溶液2毫升。

(4)将测定管溶液置40℃(±5℃)恒温水浴中保温10分钟后，加入40℃下预热的1%淀粉溶液2毫升，混匀，立即放入40℃水浴中准确保温5分钟后取出，迅速加入4毫升、0．4NNaOH溶液，以终止酶活性。

(5)测定管溶液和对照管溶液均加入2毫升3，5－二硝基水杨酸试剂。同上操作测定溶液的光密度，查标准曲线得相应的麦芽糖量。

5．计算

①α－及β－淀粉酶总活性〔麦芽糖(毫克)／鲜重(克)／5分钟〕

②α－淀粉酶活性〔麦芽糖(毫克)／鲜重(克)／5分钟〕

式中：A：1毫升待测液中在5分钟内α－+β－淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖(毫克)；

A″：α－+β－淀粉酶对照管中麦芽糖量(毫克)

B：1毫升待测液中，5分钟内α－淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖(毫克)；

B″：α－淀粉酶对照管中麦芽糖量(毫克)；

V：用于测定α－及β－淀粉酶总活性所取酶液体积(毫升)；

W：样品称重(克)。

①式中50：酶稀释液的总体积(毫升)

50：酶液的总体积(毫升)

②式中50：酶液的总体积(毫升)。