3，5－二硝基水杨酸比色法测定糖含量

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3，5－二硝基水杨酸溶液与还原糖溶液共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色强度呈比例关系，可用于比色测定，该法为半微量定糖法，操作简便、快速、杂质干扰较少。

试剂

(1)3，5－二硝基水杨酸试剂(DNS试剂)

甲液：溶解6．9克结晶酚于15．2毫升10%氢氧化钠溶液中，并用水稀释至69毫升，在此溶液中加6．9克亚硫酸氢钠。

乙液：称255克酒石酸钾钠加到300毫升10%氢氧化钠溶液中，再加入880毫升1%3，5－二硝基水杨酸溶液。

将甲乙二溶液相混合即得黄色试剂，贮于棕色瓶中备用。在室温放置7～10天以后使用。

(2)6N盐酸溶液。

(3)10%氢氧化钠溶液。

(4)碘－碘化钾溶液：称5克碘，10克碘化钾溶于100毫升蒸馏水中。

(5)酚肽指示剂。

(6)85%乙醇。

(7)0．1%葡萄糖标准液：准确称取100毫克分析纯的葡萄糖(预先在105℃干燥至恒重)用少量蒸馏水溶解后定容至100毫升，冰箱保存备用。

操作方法

1．标准曲线的制定：取9支25×250毫米的试管，分别按表3加入试剂：

表3 制作标准曲线不同试剂加入量 单位：毫升

将各管溶液混合均匀，在沸水浴中加热5分钟，取出后立即用冷水冷却到室温，再向每管加入21．5毫升蒸馏水，摇匀。于520nm波长处测其光密度值。以葡萄糖毫克数为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线。

2．样品中总糖和还原糖含量的测定

(1)样品中还原糖的提取：准确称取2克样品(以山竽粉为例)，放在100毫升烧杯中，先以少量水调成糊状，然后加50～60毫升蒸馏水，于50℃恒温水浴中保温20分钟，过滤，将滤液收集在100毫升容量瓶中，再定容至100毫升。

(2)样品中总糖的水解及提取：准确称取1克样品(以山竽粉为例)，置锥形瓶中，加入10毫升6N盐酸，15毫升水，在沸水浴中加热半小时，取出一、二滴置于白瓷板上，加1滴碘——碘化钾溶液检查水解是否完全，如已水解完全，则不呈现蓝色。冷却后加入1滴酚肽指示剂，以10%氢氧化钠溶液中和至溶液呈微红色，过滤并定容到100毫升。再精确吸取上述溶液10毫升于100毫升容量瓶中，定容到刻度，混匀备用。

(3)样品中糖含量的测定：取7支25×250毫米试管分别按表4加入试剂。

表4 制作标准曲线不同试剂加入量

加完试剂后，其操作均与制作标准曲线时相同。测定后，取样品的光密度(O．D)值的平均值，在标准曲线上查出相应的糖量。

(4)计算：

式中：A：查标准曲线所得待测样品液中还原糖量(毫克)

W：样品称重(克)；

100：样品液总体积(毫升)；

1：待测样品液的体积(毫升)；

10³：换算克为毫克；

100：换算为百分含量。

式中：A：查标准曲线得样品水解后，待测样品液中还原糖量(毫克)；

1000：样品液总体积；

其它同上。