蛋白酶活力的测定

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(一)福林－酚法

酶的活力反映了酶催化化学反应速度的本领。在单位时间内，酶催化反应其生成物越多或消耗的反应物量越大，说明催化速度越快，活力就越高。利用福林－酚法测定蛋白酶活力是当前通用的方法。我国规定，在一定的温度、pH值条件下，1g酶粉或1mL酶液，每分钟催化水解酪蛋白(或血红蛋白)所产生的酪氨酸的微克数，称为酶的活力。以“U／g”或“U／mL”表示。

1．测定原理

酪素(也称酪蛋白)是一种蛋白质，在蛋白酶的催化作用下，水解生成含有酚基的氨基酸(主要是酪氨酸)。在相同的条件下，生成的酪氨酸越多，说明该酶制剂的催化水解能力愈强，酶的活力就愈大。

水解生成的酪氨酸的量，在福林试剂与之作用显色(蓝色)后，通过比色来确定。

福林试剂即福林－酚试剂，是磷钨酸、磷钼酸的混合试剂，在碱性条件下极不稳定，容易被酚类化合物还原成蓝色化合物(钼蓝和钨蓝的化合物)。蓝色的深浅与酚类化合物的多少成正比，因此，通过比色就可确定水解产物酪氨酸的量，从而计算蛋白酶的活力。

2．设备及仪器、试剂

(1)设备及仪器

❶ 电恒温水浴。

❷ 721型分光光度计。

❸ 移液管架。

❹ 试管架。

❺ 吸液球(洗耳球)。

❻ 定性中速滤纸。

❼ 玻璃仪器。

磨口回流装置(2000mL)；

试管(1．5×15cm)40～50支；

刻度移液管(1、5、10mL)各5支；

玻砂漏斗(细菌漏斗No4～5)；

容量瓶、量筒、漏斗若干。

(2)试剂

❶ 福林试剂

1)需要药品

钨酸钠(Na₂WO₄·2H₂O)化学纯

钼酸钠(Na₂MoO₄·2H₂O)化学纯

磷酸 85%

盐酸 相对密度1．19

硫酸锂(Li₂SO₄) 化学纯

溴水 化学纯

2)配制方法

在2000mL磨口回流装置的烧瓶内，依次加入钨酸钠100g，钼酸钠25g，蒸馏水700mL，85%的磷酸50mL。浓盐酸100mL，全部加好装上冷凝器，以小火沸腾回流10h，取下冷凝器后加入硫酸锂50g，蒸馏水50mL，混匀后再加入溴水数滴，煮沸约15min，以除去多余的溴，此时溶液呈黄色(如仍有绿色则再加几滴溴水，再煮沸以除去过量的溴)。冷却后加蒸馏水将此液稀释到1000mL。混合均匀用玻砂漏斗过滤，滤液应呈金黄色，贮于棕色试剂瓶中，严防灰尘落入。本试剂可长期保存。使用时按1∶2稀释。

❷ 0．55mol·L^－1Na₂CO₃溶液：称取无水碳酸钠58．3g，溶于1000mL蒸馏水中。

❸ 100g／L三氯醋酸溶液：称取三氯醋酸100g，溶于1000mL蒸馏水中。

❹ 缓冲溶液

1)0．02mol·L^－1H₃PO₄缓冲溶液(pH7．2)

A液——0．2mol·L^－1NaH₂PO₄·2H₂O溶液：称取NaH₂PO₄·2H₂O31．2g，以水定容到1000mL。

B液——0．2mol·L^－1Na₂HPO₄·12H₂O溶液：称取Na₂HPO₄·12H₂O71．7g，以水定容至1000mL。

取A溶液28mL，B液72mL，混合后定容至1000mL。

2)0．02mol·L^－1H₃PO₄缓冲溶液(pH值7．5)

取1)的A液16mL，B液84mL混合后定容至1000mL。

3)硼砂－氢氧化钠缓冲液(pH值10．0)

A液：称取硼砂19g，以水定容至1000mL。

B液：称取氢氧化钠8g，以水定容至1000mL。

取A液50mL，B液43mL，以水定容至200mL。

4)硼砂－氢氧化钠缓冲液(pH值11．0)

取3)的A液和稀释至一倍的B液等量混合。

5)柠檬酸－柠檬酸钠缓冲液(pH值3．0)

A液：称取21．01g柠檬酸(含1个结晶水)溶解后定容至1000mL。

B液：称取29．4g柠檬酸钠(含2个结晶水)溶解后定容至1000mL。

A液与B液按18．6∶1．4混合即得。

6)乳酸－乳酸钠缓冲液(pH值3．0)

A液：0．2mol·L－^－1CH₃CH(OH)COOH。称取乳酸9g，溶解后定容至500mL。

B液：0．2mol·L^－1CH₃CH(OH)COONa溶液。称取乳酸钠11g，溶解后定容至500mL。

A液与B液按5∶1混合，再加三倍于混合液的水即得。

注：测定时只需根据酶种类的不同，选配上述缓冲液之一即可。

3．测定方法

(1)制作标准曲线

为了确定酪氨酸量与吸光度(OD值)的对应关系，需要事先以不同浓度的酪氨酸标准溶液与福林试剂反应显色，测定其吸光度，绘出标准曲线。

❶ 100μg／mL酪氨酸标准溶液的配制

准确称取在105℃烘干至恒重的酪氨酸0．1000g，用0．1mol·L^－1HCl溶液溶解，移入100mL容量瓶中，并以0．1mol·L^－1HCl稀释至标线，即得1mg／mL的酪氨酸溶液。保存于冰箱中，用时吸取10mL此液于100mL容量瓶中，以0．1mol·L－¹HCl稀释至标线，即得100μg／mL酪氨酸的标准溶液。

❷ 不同浓度的酪氨酸标准溶液的配制

取干燥试管7支，编号后按表5－5所示的量，用刻度移液管加入酪氨酸标准溶液和蒸馏水，即配成六种不同浓度的酪氨酸溶液的标准系列。

表5－5 酪氨酸标准系列的制备

❸ 吸取上述不同浓度的酪氨酸标准溶液各1mL，于干燥试管中(每种浓度都做平行试验)。分别加入0．55mol·L^－1碳酸钠5mL和福林试剂1mL．摇匀，再置40℃恒温水浴中，显色10min后，在分光光度计(或光电比色计)上用680nm波长，以零号管中的溶液(即酪氨酸的浓度为零)作零点，测定各管中溶液的吸光度(平行两份之差不得超过0．01)。

❹ 以吸光度值为纵坐标，酪氨酸浓度(μg／mL)为横坐标，作一标准曲线，此线应该通过零点。

(2)样液制备及测定

❶ 底物的制备

测定中性、碱性蛋白酶的活力可配制2%酪素溶液。

称取酪素2g，按不同酶种加适量的0．5mol·L^－1NaOH溶液湿润片刻，再加与待测酶种相应的少许缓冲溶液，在沸水浴中加热到完全溶解(溶液应为透明)，冷却后用精密pH试纸检查。调节溶液的pH值到该酶反应的最适pH值，然后用相应的缓冲溶液定容至100mL，置于4℃的冰箱中保存，超过5天应另行配制。

测定酸性蛋白酶的活力需要配制如下三种底物之一种。

1)0．5%酪素

称以酪素0．5g，加入约50mLpH值3．0的缓冲溶液调溶，然后在沸水浴中加热，到清晰透明，冷却后再以上述缓冲溶液定容到100mL，若有泡沫，可加1～2滴无水酒精消除。置于4℃的冰箱中保存，超过五天另行配制。

2)0．5%国产血红蛋白(pH值3．0)

称取国产血红蛋白0．5g用50ml0．02mol·L－1HCl溶解后过滤，再以此盐酸多次洗涤滤渣，滤液定容至100mL。

3)1．5%进口血红蛋白(pH值3．0)

称取进口血红蛋白1．5g，按上述方法配成100mL溶液。

❷ 待测酶液的制备

下面两种方法可任选一种，但在报告中最好注上是否经过过滤。

第一种方法：准确称取酶粉2g，用约100mL与该酶种相应的缓冲溶液调溶，然后用上述缓冲溶液定容在200mL容量瓶中，振荡使其充分溶解。吸取一定量的上层清液用上述缓冲溶液稀释在一定量的容量瓶中摇匀备用。(稀释倍数应控制在使水解产物与福林试剂显色后，OD值在0．2～0．4范围内。)

第二种方法：准确称取酶粉2g，以少量与该酶种相应的缓冲溶液溶解，并用玻棒捣研，将上层液小心倾入100mL容量瓶中，余渣部分加入上述缓冲液。如此反复捣研3～4次，最后全部移入容量瓶中。用上述缓冲溶液定容至标线，摇匀。用八层干纱布过滤。根据酶的活力，再将滤液吸出一定量，用上述缓冲液稀释至适当倍数待用(稀释倍数要求同上)。

若被测样品为液体，则视其活力的大小进行适当稀释。

❸ 测定步骤

将底物在40℃恒温水浴中预热3～5min，取干燥试管3支编号后加入待测酶液1mL。放入40℃水浴中预热3～5min后，严格按表5－6的顺序加入各种溶液。

加入三氯醋酸以后立即摇匀，在室温下放置5min，以干滤纸滤入干燥试管中，分别吸取滤液1mL于事先编好号的对照试管中，再加入0．05mol·L^－1Na₂CO₃5mL，福林试剂1mL，摇匀后置40℃水浴中显色10min，以对照管为空白，在分光光度计(或光电比色计)上测定吸光度。

表5－6 溶液加入顺序

❹ 说明

1)在酶的催化反应过程中，由于产物的形成会影响溶液的pH值，因此使用缓冲溶液来保持酶作用的最适pH值。

2)当酶促反应到规定的时间时，用三氯醋酸终止酶的活动。三氯醋酸虽是有机酸但其酸性几乎接近于硫酸，可在极短时间内使酶蛋白质变性失活，提高测定的准确性。

3)制备酪氨酸标准液前，应将酪氨酸在105℃下干燥2～3h，以去除水分保证标准液的可靠性。

4)制作标准曲线时，用稀盐酸溶解酪氨酸(也可溶于碱中)。是为了与实测时保持同样的酸性条件(以三氯醋酸终止酶促反应后的水解液也是强酸性)，以提高测定的精密程度。

(3)计算

根据定义，在一定条件下1g酶粉或1mL酶液，每分钟水解酪蛋白(或血红蛋白)产生的酪氨酸的微克数称为酶的活力。以U／g或U／mL表示。

❶ 若样品为酶粉，按下式计算

式中 k⁽¹⁾——标准曲线上OD为1时所相当的酪氨酸浓度(μg／mL)，即比色计常数；

N——配制待测液时总的稀释体积(mL)；

——水解反应时试液总体积为6mL，故应为6；水解反应时间为10min，故除10；

m——酶粉样品质量(g)；

OD——在分光光度计上测出的吸光度。

❷ 若样品为酶液，按下式计算

式中 V——酶液样品量(mL)。

其余各项意义同前式。

(4)讨论及注意事项

❶ 目前我国测定蛋白酶活力都是用福林法，虽然测定时都在最适条件范围内但测定条件尚不完全统一。如有的水解时间为15min，有的10min，有的40℃，有的30℃，在不同条件下测出的结果相差很大，这里选用的足一般酶制剂厂规定的条件。为了在应用中具有可比性，在报告测定结果时应说明测定条件。

❷ 由于现用酶制剂是粗制品，颗粒大小不均，又有杂质及不溶物混在一起，尤其是填料能吸附一部分酶体，为了能使酶被充分浸提出来，在制备酶液时需充分溶解，用缓冲溶液反复浸提数次，最后将酶液及残渣全部转入容量瓶中定容，待用。

❸ 水解反应时各种溶液的吸取量一定要准确，要使吸管内壁溶液尽量流出，而管外壁的液体用滤纸擦掉，反应时间、温度、pH值均应按规定控制。要注意具体操作细则，否则会因较小的操作差错得出不准确的结果。

❹ 加入三氯醋酸后要静置过滤，要求滤液澄清透明，否则会由于带入沉淀颗粒而影响比色结果。

❺ 制好的福林试剂应呈金黄色，若呈现绿色表示此液中还有还原性物质存在，会使测定结果偏高。

❻ 标准曲线应定期校正，更换试剂时需要另作标准曲线。

❼ 底物酪素必须经过氢氧化钠润涨后才能完全溶解。配制后应放在低温下保存。

❽ 标准曲线上的横坐标是酪氨酸标准液序列的浓度，为了取正数便于作图，应精确称取0．1000g酪氨酸配制标准液。

(二)LÖhlein-volhard(LVU)蛋白酶活力的测定

1．原理

当酪素被蛋白水解酶分解之后，其分子量较大的组分可通过加盐酸和硫酸钠而沉淀出来。在滤液中，溶解的酪素和过量盐酸可用碱进行滴定。通过耗用的碱量即可测得酶制剂的活度。

2．定义⁽²⁾

1个LÖhlein-volhard(LVU)单位，系指在1小时，37℃的给定条件下，20mL滤液内所增加的水解酪素的量(与空白相比)，相当于5．75×10^－3mL0．1mol·L^－1NaOH。

3．底物

4%酪素溶液的制备是将20g酪素(酪素采用Hammarsten，Merck No．2242)，分散于350mL去离子水中，并加以搅拌使其全部分散不含块状物，再于此分散液中加入32mL0．5mol·L－^－1NaOH⁽³⁾溶液，搅拌均匀，置于60℃水浴中30min令其全部溶解，冷却后加入0．3mL甲苯，检查pH值，若pH值不是8．2，则用0．1mol·L^－1HCL或0．1mol·L^－1NaOH调到pH值8．2。然后加入去离子水稀释至500mL。

只要酪素溶液的pH值不降低到8以下，则此溶液在2～4℃的冰箱中最多保存2天，如果它的pH值降到8以下，则此酪素溶液决不能再用，必须另配新液。

4．酶制剂溶液的配制

在室温下用去离子水制成的1%硫酸铵溶液溶解酶制剂，如果不能溶解，则摇动20min，必要时可过滤。如果所配酶溶液的pH值不是8．2，则应很小心的调到8．2。

LVU／g 试样质量，mg

1000 350～400

5000 70～80

10000 35～40

50000 7～8

220000 1．6～1．8

5．分析步骤

将50mL上述酪素溶液置于37℃下15min，加入10mL酶溶液，轻轻摇匀，再将此混合物置于37℃恒温器中60min，然后加入20mL

0．2mol·L^－1HCl以终止水解，将容器摇动，同时立刻加入20mL 10%的硫酸钠溶液静置15min，用直径为13．5cm的圆形滤器(Schleicher & schull，Blauband)过滤。

酶的空白试验按下列顺序进行：

10mL酶溶液(如上所述)

20mL0．2mol·L^－1HCl

50mL酪素溶液(如上所述)

20mL 10%硫酸钠溶液

将此混合物混匀静置15min，再按前述方式过滤。

6．滴定

在容器中加入20mL滤液，再加入用75%乙醇配制的1%α－萘酚酞指示剂5滴，用微量滴定管(其刻度必须清楚易读)以0．1mol·L^－1的NaOH溶液滴定，如果可能，则滴定两次。

试样滴定及空白滴定所耗碱量之差的允许范围介于1．9～2．3mL 0．1mol·L^－1NaOH之间。

7．计算

滴定结果按下式计算

式中所耗碱量是指试样所耗碱量与空白所耗碱量之差。

以上计算是认为碱的消耗量与酶浓度之间存在线性关系，因此，所称取酶试样的质量应该使它的耗碱量介于1．9～2．3mL之间，如果需要，可将此范围扩大一些，但必须有一事先确定的校正因子。