薄层色谱扫描法

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薄层色谱扫描法薄层色谱色斑的测定用薄层色谱扫描仪，是用一定波长，一定强度的光束直接照射在薄层色斑上，根据光强度的变化，从而进行定性和定量测定。

双波长测定法是利用两束不同波长的单色元λ_s和λ_R交替照射在色斑上，测定其吸收值差△A。

∵A=KC 而选择λ_R对色斑无吸收或吸收小

∴Aλ_R=0

△A=Aλ_s－Aλ_R

∴△A=Aλ_s

吸收值差与被测样品量成正比关系。由于色斑对光有了吸收，在记录纸上呈现出一个峰，根据峰面积大小，即可计算出色斑中化合物的量。在仪器上，经过自动计算，显示出积分值。

测量方法有3种：

❶ 透射法 单色光垂直照射在薄层表面，并透过色斑，测量透射光的强度，以测定斑点内被测物质的量。

❷ 反射法 单色光垂直照射薄层色斑后，测量其反射光的强度，以测定色斑内物质的量。

❸ 荧光法

(1)直接测定法 在紫外光照射下色斑产生荧光，直接测量色斑所发生荧光的强弱而定量。空白的薄层部位必须设有荧光产生。

(2)荧光减退法(荧光熄灭法) 在薄层固定相中加入适当的荧光物质，在紫外光照射下薄层产生荧光，而色斑所在位置由于化合物吸收了紫外光，薄层上荧光物质所接收的紫外光量减少，故荧光强度减弱，即在荧光背底上出现暗斑。荧光也按比例减弱。

扫描形式

❶ 线性扫描 用和色斑直径等长的狭缝状光束单向扫描，称为线性扫描。

❷ 锯齿形扫描 用一个正方形光束(1．25mm×1．25mm或更小)照射色斑，或锯齿状扫描，称锯齿形扫描。

例如金银花中异绿原酸和绿原酸的薄层扫描测定，将金银花的甲醇提取液和异绿原酸、绿原酸对照品，分别点在硅胶薄层板上，用醋酸丁酯－甲酸－水(7：2．5：2．5)为展开剂展开后，用薄层扫描仪扫描·

扫描条件：

波长 λ_s334mm λ_R400mm

扫描方式 锯齿形扫描

浓度与积分值的关系：异绿原酸的量在3μg内，绿原酸的量在4μg之内，浓度与积分值成线性关系。用比较法分别求出绿原酸与异绿原酸的含量。