荧光钙探针试剂

---

细胞和体液中的钙离子调节著许多生物化学反应，例如酶促反应的激活与抑制，激素的分泌释放，收缩蛋白运动的控制以及离子通道的开与闭等。

除此以外，细胞内钙也参与疾病的形成与发展。钙离子起著如此重要的作用自然就提出了怎样标记和无损伤测定钙离子浓度的问题。

目前测定细胞内钙离子浓度有各具特色的不同方法。

80年代荧光钙探针试剂的发现使荧光钙探针试剂法测定钙的选择性和灵敏度在各种方法中显出特点，而且可以用无损伤细胞的方法测定细胞内游离钙的浓度，因此受到普遍重视并进入实用阶段。

无损伤测定细胞内游离钙的浓度困难在于要求有某种钙探针试剂能够通透细胞膜并在细胞内与钙离子发生作用，且反应灵敏度足以达到准确测定的要求，以及10^－3m／L Mg²⁺不干扰测定等。近年来合成的一系列新荧光钙探针试剂的应用使问题得到了比较满意的解决。

要获得一种选择性好的荧光探针试剂，确定选择性功能团是重要的一步。TsienRY等合成和应用的一系列荧光钙探针试剂当中优选了EGTA为新荧光钙探针试剂的络合功能团。

现在常用的Fura2等荧光钙探针试剂采用EGTA为选择性功能团是试剂获得成功的重要因素之一。由于选择性功能团EGTA的确定，使Fura2类似物具有优良的选择性，为新型荧光钙选择性探针试剂的研究打下了基础。

EGTA是Ca²⁺的选择性功能团，但是不能成为钙的选择性荧光探针试剂。显然这主要是因为荧光强度低以及酸效应太大。

由此可见，保持EGTA功能团结构，引入苯环改变体系的电子云密度，增加发色团和增大发色分子的共轭体系是很好的一种方法。因此人们在BAPTA分子结构中引入荧光很强的芪得到Fura2类似物，取得重大的研究进展。

Fura2类似物的确在选择性、响应时间，无损伤细胞的通透方式等方面具有先进性。然而Fura2等试剂结构中尽管引入了吸电子取代基－CN，－COOH，但激发和发射波长红移不多，仍工作在紫外光区。

为此A．Minta、J．P．Y．Kao和Rr Tsien提出引入荧光酮和罗丹明类化合物到新型荧光钙试剂结构中，使新的荧光钙探针试剂工作在可见光谱区域内。目前以Fluo3受到重视。

为了增大发色分子的截面积，改善发色系统及合成荧光酮结构的新荧光钙探针试剂，陈震华，喻忠义，尹权设计并合成了一组新荧光钙探针试剂，其中已合成的Wuro 4在H⁺浓度5．62×10^－8mol／L时能穿透鼠肝细胞进行荧光标记。

选择性钙探针试剂也能改造成显色剂和发光试剂。

喻忠义，陈震华，尹权设计和合成的Wazo类显色剂可作荧光钙试剂使用，Wazo 1已用于血清中钙含量的测定，结果令人满意。

S．R．Adams等从乙撑上进行试剂改进得到Ca²⁺的发光试剂，其中Nitr2被认为是较好的一种。

目前中国已合成Fura2，Fura3和Wazo Wuro 4供应用和基础研究。一般来说，试剂合成反应步骤多，纯度要求高使得荧光钙探针试剂的合成有相当难度。

因此设计并合成新型荧光钙探针试剂以及研究反应机理，提高反应产率，减少反应步骤，保证试剂的纯度自然成为生化试剂工作者注视的目标。

以酸式盐提供的荧光钙探针试剂由于不亲脂，通透细胞困难。因此常常将荧光钙探针试剂做成亲脂的乙酰羟甲基酯以增强其通透细胞的性能，例如常用的Fura2－AM等。在细胞内酯酶能将酯类化合物水解成易与细胞内游离钙形成络合物的游离酸或其盐。

曾有报导，将纯度99．4%的Fura2－AM在－30℃保藏，定期解冻以高效液相色谱分析，实验证明保藏近一年测得纯度为99．1%，几乎没有改变。对于试剂的水溶液，通常只宜保存30d左右。

长时间贮存其水溶液，EGTA功能团有分解的可能。

新型荧光钙探针试剂的重要用途之一是用荧光显微镜测定单个细胞内钙的浓度，目前已能定量测定多种动物细胞内游离钙的含量。对于植物细胞来说，荧光钙探针试剂穿透能力相对来说弱得多。

因此测定植物细胞内游离钙含量正成为研究热点之一。

以荧光分光显微镜测定单个细胞内的游离钙含量，能观察细胞内不同部位Ca²⁺浓度的变化情况，方法准确可靠。此外，这类试剂也用于荧光标记和临床分析。

。【参考文献】：

1 Tsien R Y．Nature，1982，298∶478～483

2 Grynkiewicz G，Poenie M．Tsicn R Y J，Biol Chem，1985，260∶3440～3450

3 吴兰．化学试剂，1988，10∶273～282

4 カルシゥム研究会，株式会社同仁化学研究所，细胞内力ルシゥムの测定法(讲演要旨集)，1988

5 Adams S R，et al．J Am Chem Soc，1988，110∶3212～3216

6 Minta A，et al．J Biol Chem，1989，264∶8171～8174

7 中国医学科学院药物研究所，钙拮抗剂研究和细胞内游离钙的测定方法，1990

8 邓必阳，陈震华，尹权．化学试剂，1992，14∶40～45。

9 喻忠义，陈震华，尹权．第1届全国生物分析化学学术讨论会论文集，1992，291～294

10 陈震华．分析科学学报，1993，3∶73～78

(武汉大学陈震华副教授撰)