荧光分光光度术

荧光分光光度术是测定荧光强度与波长关系的一种技术，是光谱技术的一个重要分支。
荧光的产生 某些物质的分子吸收了电磁波能量，由基态跃迁到较高的能级（激发态）后，首先以热的形式损耗一部分能量，下降到第一电子激发态的最低振动能级，然后再由这一能级下降到基态的任何振动能级，同时将多余的能量以光量子的形式发射出去，所发出的光称为荧光。荧光量子的能量小于所吸收的入射光量子能量，所以荧光的波长大于入射光的波长。产生荧光的过程很快，约在10-8s内完成。一旦除去激发光（入射光），荧光也随之消失。
荧光分析的原理 对于低浓度溶液荧光强度F由下式表示：

F=2.303φKAI₀

式中φ为荧光量子产率，A为消光度(A=LεC),L为样品池长度，ε为克分子消光系数，C为待测样品浓度，I0为激发光强度，K为仪器的探测效率。
由式中可以看出：
❶对于浓度很低的同一种溶液，当KI0Lε一定时，荧光强度F与样品浓度成正比。这就是荧光定量分析的基础。即通过测定溶液的荧光强度可以进行样品的定量分析。
❷当φKCLε一定时，荧光强度与激发光强度成正比。提高光源发光强度可以提高仪器的灵敏度。所以荧光分光光度计多采用强光源。若采用激光做光源，灵敏度更高，可用来测定空气中微量的污染物质。
❸当φI0A一定时，荧光强度与仪器的探测效率K成正比。所以采用高灵敏度、低噪声的光电倍增管及优良的电子学线路可以提高仪器的灵敏度。
荧光分析仪器 荧光分析仪器种类繁多，主要有目测荧光计、滤片荧光计、荧光分光光度计、细胞荧光分光光度计等，应根据荧光测量的不同要求，合理地选择适宜的仪器。
荧光分析仪器主要包括光源、激发单色器、样品室、发射单色器、探测器、放大器及记录显示装置(图1)。图中

图1 荧光分光光度计示意图

P1P2为光电倍增管，S1、S2、S3、S4为狭缝，K1、K2、K3为放大器，G1、G2为光栅，M2、M4为聚光镜。
(1)光源： 荧光分光光度计要求能测定各种物质的光谱图，需要选用不同波长的光来激发样品，因此要求光源最好具有连续光谱。荧光分光光度计通常采用直流氙灯作为激发光源，它发射从紫外到近红外的连续光谱。其可见光部分与日光相似而且发光强度大，发光面积小，近似于电光源，是较理想的光源。为了使氙灯发光强度保持稳定，一般由直流稳流电源供电。有些仪器采用汞灯做光源，汞灯有几条很强的谱线，由于它的谱线不连续，使用受到限制。
(2) 单色器： 单色器是能获得波长范围很窄的光的一种分光装置。荧光分光光度计多采用光栅或棱镜作为分光元件。由于光栅比棱镜具有更多的优点，所以应用更广泛。单色器都有入射狭缝和出射狭缝。通常两者可以同步调整，即能联动。有的仪器则采用固定狭缝。狭缝宽度是决定仪器分辨率的重要因素。它直接影响单色器的光谱宽度。狭缝关小时，光谱宽度变窄，即单色光的单色性好，分辨率高。但这时光能量减小，灵敏度降低。狭缝宽度应根据样品的浓度、特性及使用要求选择。一般测激发光谱时，激发单色器的狭缝应窄些，而测发射光谱时，发射单色器的狭缝应窄些。
(3)样品室： 样品室内可安放标准样品池架，表面荧光附件、荧光偏振附件、微量池、流动池、薄层层析及恒温附件等。
(4) 探测器： 通常用光电倍增管作为探测器，把从发射单色器出射狭缝出来的光转换成电信号。光电倍增管的灵敏度随着波长而变化，即它具有一定的光谱特性。光电倍增管由高压稳压电源供电，它能把微弱的荧光信号放大数十万乃至数百万倍。
(5) 放大及记录显示： 把光电倍增管输出的信号送到前置放大器和主放大器放大，最后用记录仪、电表或数码管把荧光信号记录或显示出来。
荧光分析中所测定的参量 (1)激发光谱和发射光谱：激发光谱就是固定发射波长及谱带宽度，而让激发光单色器的波长连续扫描，所记录的光谱图。它反映了不同波长激发光产生荧光的相对效率。所谓发射光谱 （也称为荧光光谱）则是固定激发光波长及谱带宽度，而让发射光单色器的波长连续扫描，所记录的光谱图。它反映了荧光强度随波长变化的情况。
不同的物质具有不同的荧光激发光谱和发射光谱。根据光谱的形状可以进行物质的定性分析，即利用所测得的光谱与已知物质的标准光谱比较来判断物质的组分。特别是荧光分光光度计能获得两种光谱，用这两种光谱图鉴定物质的组分比单纯根据吸收光谱更可靠。
为了得到某一荧光物质的真实激发光谱，不同波长的激发光都应以相同的量子数作用于荧光物质。但实际上每一种光源都有一定的光谱分布，即光源发射的不同波长的光，具有不同量子数。另外棱镜或光栅对于不同波长的光线有不同的分光效率。因此所得到的激发光谱不能代表被测物质的真正激发光谱，这种光谱中还包括了仪器的因素，一般称之为表观光谱。与此类似，光电倍增管对不同波长光的响应不同，所以得到的发射光谱也只是一种表观光谱。为了获得真实的激发光谱和真实的发射光谱，还需要对

图2 硫酸奎宁的激发光谱与发射光谱

表观光谱进行校正，方得真实光谱。
由于荧光的产生与吸收有关，校正后的激发光谱和同一物质的吸收光谱相似，而物质的发射光谱和它本身的吸收光谱常呈镜象对称关系。
(2)荧光量子产率： 荧光量子产率φ等于所发出荧光的量子数和所吸收激发光的量子数之比值。

由于吸收光子的能量有一部分消耗为热或消耗在其它非辐射性过程，并不能全部转变为荧光，因此发射荧光光子只占吸收光子的一部分。量子产率表征荧光物质发射荧光的效率。测定量子产率可以了解物质的发光能力，还能说明各种不同环境条件对发光物质的影响以及该物质分子与附近其他分子之间的能量传递情况，进而测定分子间距离。
(3) 荧光寿命： 分子从吸收光到发出荧光之间有一定的时间间隔。在去掉激发光后，荧光强度将按指数规律下降，降到激发时最大荧光强度的1/e所需时间称为荧光寿命。
荧光寿命的测定对于研究分子间反应动力学、能量转移与分子间距、分子间的旋转扩散等都可得到重要的信息。
荧光分析的干扰因素 荧光分析不足之处是环境干扰因素比较多。为了得到准确的实验结果，在实验中应尽可能避免或加以修正。主要干扰因素有：
(1) 光分解： 荧光物质因吸收光能使某一键断裂的现象称为光分解。由于光分解将导致荧光强度逐渐减弱，浓度愈小，光分解愈严重。因此样品应以较浓溶液作储备液，使用前临时稀释；在激发光照射后立即进行测定； 溶液尽量保存于棕色瓶中，避免灯光和日光照射。
(2) 温度猝熄： 温度升高时荧光减弱的现象叫温度猝熄。因此在荧光测定时应尽可能减少不必要的照射或在样品室安装恒温设备。
(3) 浓度猝熄： 在溶液浓度较稀时，荧光强度与浓度成正比。但浓度增大到某一程度后，荧光反而随着浓度增加而下降。这种现象称为浓度猝熄。因此定量分析中应使浓度保持在线性范围内。对于浓度很高或混浊样品可用表面荧光（或固体样品）附件测定。
(4) 杂质猝熄： 由于荧光分子以外的其他分子与荧光分子相互作用而使荧光量子产率减少的现象称为杂质猝熄。实验中应予注意。
荧光测定中对所使用的试剂，样品杯等都有较高的要求。另外散射光（如瑞利散射和拉曼散射）、溶液的pH值等对荧光测定也有一定的影响。
生物医学中的应用 荧光分析的灵敏度很高。它比一般分光光度法灵敏一百至一千倍，能探测10-11～10-11克的痕量物质。它能给出激发和发射两种光谱，因此它在鉴定物质时，选择性更强。荧光分析试样用量少，测量方法简便，分离要求不高，此外它能提供较多的物理量，如量子产率，荧光偏振和荧光寿命等。所以它在生物医学中用途广泛。七十年代以来，荧光技术发展迅速，目前已成为药理学、免疫学、卫生学、临床医学、分子生物学和细胞生物学研究中的一项重要技术。
利用荧光物质本身的荧光可以直接进行检测。有些物质本身不发荧光或量子产率低不易测定，这时可以利用某些特异反应使其产生荧光衍射物，然后进行测量。还有些物质能使荧光猝熄，所以测定猝熄后的荧光强度也可以测出猝熄物质的含量。目前可用荧光法测定的元素有六十余种，化合物达数千种。生物体内荧光物质，以及具有荧光性质的外来物质种类繁多，包括蛋白质、辅酶、氨基酸、胺及其代谢产物、维生素、激素、甾族化合物、药物及毒物（包括致癌物质）等。这些物质都具有荧光，只需将血、尿、组织及蛋白水解产物进行适当处理，提取或分离，即可根据其荧光性质进行辨认。在和标准物进行对比后，即可对其进行定性和定量测定。在临床化验中利用荧光分析可测定多种生化指标。
由于荧光分析灵敏度很高，因此对血液、尿和组织的取样量很少。例如用一滴血就能测定血液中葡萄糖的含量。用荧光法进行酶的定量分析，灵敏度也很高。化验肝功能的转氨酶如采用荧光法替代比色法，抽血量可减为1/1000。甾族化合物用荧光法测定的灵敏度很高如雌酮能测到1×10-¹¹g，孕甾酮能测到1×10^-10g。
许多药物能用荧光法进行分析和鉴别。如有些药物注射剂量很小，有时低到100μg/L水平，用荧光法能化验出它自体内的排泄量，例如阿斯匹林可测到10^-8g，青霉素可测到5×10^-8g，链霉素可测到1×10^-9g。
在环境保护和卫生防疫工作中荧光法也得到了广泛应用，可用来测定空气、水源和食物的污染，其中有些是致癌物质，这些物质大多能发荧光，一般能测到10-8g。例如3,4苯并芘是一种强的致癌物质，存在于废气、香烟烟雾、某些水源和食物中，用荧光法测定灵敏而可靠。又如发霉的花生和烟叶中的黄曲霉，也可用荧光法测定其强毒性代谢产物。污水中一些有害的重金属离子，也可通过间接方法测定其含量。如铅可测到5×10-8g，汞可测到1×10^-9g。
荧光法也应用于蛋白质、氨基酸、胺、核酸和维生素等的分析。例如核酸的荧光量子产率很低，一般难于测定，但它与荧光探剂菲啶溴红有特异的结合能力，结合后荧光强度显著提高，分析灵敏度亦大为提高。
小分子与大分子的结合是研究药物与受体、抗体与抗原、酶与辅基等重要生物活性物质的基础。在结合时小分子或大分子的荧光参数发生变化，利用这些变化可以了解分子的结合情况。利用荧光探剂可以研究生物大分子的某些构型。当荧光探剂和大分子或膜结合时物理性质发生变化，这种变化可以探测大分子或膜的结构状态及其环境，也可以了解微环境的极性、粘滞性、化学基团之间的距离等。因此荧光分光光度术在分子生物学中也得到了广泛的应用。