荧光偏振fluorescence polarization

由偏振光激发物质时，物质分子发射具有偏振特性的荧光。它是由平面偏振光激发荧光系统，由分子的旋转运动所产生的消偏振作用使得发射光为部分偏振，测定发射光的消偏振作用程度获得大分子物质的大小、形状及结构（挠性）的信息；了解分子间的结合程度；检测蛋白质的聚合与解聚、变性蛋白质的二硫键等。荧光的偏振性质可用荧光显微镜作目视观察，也可用荧光分光光度计或显微荧光分光光度计（均带有偏振件）进行精确测量。

荧光偏振fluorescence polarization

指借测定物质受光激发后所发荧光的偏振度，以了解物质分子结构特点的分析方法，称荧光偏振法。偏振度P表示荧光的偏振程度，可用下式计算： P=I_VV-I_VH)/H_VV+I_VH。式中I_VV为起偏器和检偏器均置于垂直位置时所测得的荧光强度，I_VH为起偏器位于垂直位置而检偏器位于水平位置时所测得的荧光强度。

荧光偏振

荧光偏振是指物质发出的荧光是一种偏振光，亦即光波中的电场（或磁场）在某一方向具有明显的优势。荧光偏振与发光分子的有规则排列有关，因此根据荧光偏振测量可以了解发荧光分子的有序程度和活动性。
基本原理 光是一种电磁波，它包含有电场E变化和磁场H变化。电场的方向和磁场的方向互相垂直，并且都垂直于电磁波的传播方向。
如果光波中的电场E均匀分布于各个方向，这种光称为自然光，普通光源如氙灯，汞灯和白炽灯等发出的光都属于自然光。对着光传播方向观察时E的分布如图1左所示。如果光波中的电场E都在一个平面内变化，这种光称为平面偏振光(图1中)，在某一方向占优势者则称为部分偏振光(图1右)。

图1 自然光、平面偏振光和部分偏振光

自然光通过电气石、冰洲石、偏振片或其它各种能产生偏振效应的物质就能产生偏振光，即上述各种物质只允许一个方向的电场（或磁场）通过。电气石、冰洲石等双折射晶体由于透光率低使用受到限制，目前用得最多的是偏振片。
将聚乙烯醇薄膜浸碘后，经拉伸定向处理可制成偏振片。为了增加偏振片的机械强度，一般将膜片粘在两块保护玻璃（或石英玻璃）片之间。
荧光偏振可以采用带偏振附件的荧光显微镜，通过眼睛观察测定，但精确度较差。一般采用带有偏振附件的荧光分光光度计（或显微荧光分光光度计）进行测定。
在光源与样品之间放一块偏振片，由光源发出的自然光通过偏振片后变为偏振光。此偏振片起着产生偏振的作用，称为起偏振片。不论如何旋转偏振片，偏振光强度保持不变。在样品与发射单色器之间再放一块偏振片(如图2所示)，通过第二块偏振片后的光强度与这两块偏振片的相对取向有关。如果样品所发生的荧光是偏振的，则旋转第二块偏振片可以使光强从最大逐渐减至最小，第二块偏振片起着检查偏振的作用，称为检偏振片。

图2 荧光偏振测量装置示意图

光的偏振程度可用偏振度表示，偏振度可由下式计算：
　式中P表示偏振度，V表示偏振片置于垂直位置，H表示偏振片置于水平位置，Ivv表示起偏振片和检偏振片均置于垂直位置时所测得的荧光强度，IVH表示起偏振片位于垂直位置而检偏振片位于水平位置时所测得的荧光强度。自然光P=0，完全偏振光P=±1，部份偏振光P值在0与±1之间。
在不同的激发波长下测得的P值不同。如果以偏振度对激发波长作图，则可获得物质的偏振谱。偏振谱反映了物质的特性，利用偏振谱可辨认荧光物质或其中的吸收基团。图3为荧光素的吸收谱和偏振谱(浓度5×10-6M，溶于95%甘油，5%0.1N NaOH)
偏振度的测定精度取决于仪器的精确度与信噪比。当使用优良仪器时，对于高量子产率的物质，P值的测定精度可达±0.002。
荧光偏振的应用在生物医学中常遇到发光分子有一定的取向，在不同的环境条件下又常有改变。因此荧光偏振是研究分子排列与构型的重要手段，它在生物医学中应用广泛。

图3 荧光素的吸收谱与偏振谱

通过测定荧光偏振，可以获得生物大分子的许多信息，例如大分子的大小、形状和构象等。利用荧光偏振能分析同种分子之间的能量转移现象，而用一般的荧光法是无法测定的。通过测定荧光偏振也能了解小分子和大分子的结合程度。此外，荧光偏振还能用于检测蛋白质的聚合与解聚，从螺旋到无规则卷曲的变化情况及检测变性蛋白中的二硫键等，兹举二例。
(1) 通过荧光偏振的测量了解分子的大小、形状： 分子的转动可以产生消偏振（即偏振度降低）现象，这些现象又和温度、粘度和分子的大小及形状有关。Perrin曾研究过这些参数之间的关系，得出下列基本公式：式中P为偏振度，P0为极限偏振度(即粘滞性极大，温度极低时的P值),τ为荧光寿命，R为气体常数(其值为8.314×107ergs/mol·°K),T为绝对温度，η为粘滞系数，V0为分子体积，ρ为旋转弛豫时间，是一个衡量分子在粘滞介质中因转动而丢失能量的速度的物理量。在用自然光激发时，用上式中的“+”号； 用偏振光激发时用“-”号。利用公式(2)可以研究大分子的一些性质以及小分子与大分子的相互作用。
例如根据Perrin公式，改变样品的T与η，作1/PT/η图，如果大分子为球形，则将得到一条直线； 如果大分子不是球形，则有一种以上的旋转运动，这时得到的将是一条曲线，由此可以判断分子的形状。从上述图线和纵轴(即1/P轴)的交点可求出P₀，如用其它方法再测出荧光寿命τ，就可以求得大分子体积V0，也可以求出旋转弛豫时间ρ。
(2) 研究荧光偏振是研究细胞膜流动性的重要手段之一，用疏水性的荧光探剂标记膜的脂相，通过测定膜的荧光偏振度，即可分析某一特定细胞膜的流动性。流动性越大，P值越小。在各种生理和病理状态下膜的流动性是不同的。实验表明淋巴细胞白血病患者淋巴细胞膜流动性较正常人显著增高(见《细胞膜流动性》)。许多麻醉药作用于细胞后，膜脂的流动性也增大，因此荧光偏振可用于麻醉机理的研究。