肽链合成的终止

肽链合成的终止是合成作用的最后阶段。完成的肽链与tRNA连接的酯键被水解，肽链以及mRNA和tRNA从核糖体脱落，核糖体解缔。原核细胞和真核细胞的肽链终止都需要称为释放因子的可溶性蛋白质参加： 从原核细胞分离鉴定出识别UAA和UAG的释放因子1(R-F1)和识别UAA和UGA的释放因子2(RF2); RF1和RF2与核糖体的相互作用为另一可溶蛋白质RF3所促进。RF3与GDP及GTP相作用而使RF1或RF2从核糖体解缔。从真核细胞分离出一种释放因子(RF)，它可识别所有三个终止密码子。网织红细胞RF的活性为GTP所促进，并表现出依赖核糖体的GTP酶活性。终止作用时肽基tRNA的水解须有核糖体肽基转移酶参与。
识别终止密码子需要特别因子的参加是在1966年提出的，到1967年就在细菌提取液上清部分鉴定出这种蛋白质因子。噬菌体R17的一种突变株的mRNA在其N末端的一个氨基酸密码子突变成为UAG后，据此合成的不是原先的外壳蛋白而是一种六肽(f甲硫-丙-丝-天胺-苯丙-苏)。若在体外合成体系中略去所需氨基酸，则寡肽tRNA的合成就停止在终止阶段之前。如略去苏氨酸，就只合成与核糖体结合的五肽tRNA。然后加入苏氨酰tRNA至五肽tRNA·mRNA·核糖体复合体，可形成六肽tRNA-mRNA·核糖体，并且AUG密码子移至A位，但是六肽从核糖体上脱落则还要加入上清液部分的蛋白质因子。还可以测定fMet从fMet-tRNA-AUGUAG-核糖体上的释放以证明释放因子的参与了终止反应。终止密码子的表达依赖于RF，而且fMet的释放速度与RF浓度成正比。大肠杆菌RF制品经DEAE葡聚糖柱层析可分离出各具密码子特异性的两种RF。先洗脱下的是RF1，对UAA或UAG有活性，对UGA无活性；后洗脱下的是RF2，对UAA和UGA有活性，而对UAG无活性。RF1分子量44,000,RF2 分子量47,000。一个大肠杆菌约含500分子RF1和700分子RF2。它们识别密码子，但不是核酸。两种RF对核酸酶A或T1均不敏感。经分析，每分子RF1含P原子不到1个，每分子RF2含不到0.1个Up或Ap残基。即使无肽基tRNA水解，RF也按密码子特异性结合到核糖体上。释放因子、终止密码子三核苷酸和核糖体可在乙醇下形成稳定的中间体；以放射性终止密码子三核苷酸作实验则因形成中间体而保留在微孔滤膜上。RF1和[3H]UAA或[3H]UAG与核糖体的结合与非放射性UAA和UAG 有竞争作用，与UGA则无。通过平衡透析方法也可以说明甚至在无核糖体时含终止密码子的寡核苷酸也可被RF分子识别。携带氨基酸的校正tRNA (Su+tRNA)可读出终止密码子而参与蛋白质合成。改变体外蛋白质合成体系中RF或Su⁺AA-tRNA的浓度，肽链终止(RF介导)或校正作用(Su⁺AA-tRNA促成)的程度随之改变，说明释放因子和校正tRNA有竞争，支持了RF1和RF2都是识别密码子本身的论点。
释放因子3分子量77,000，无释放肽链的活性，但在体外实验中它促进由RF1或RF2及终止密码子介导的甲酰甲硫氨酸的释放。由于肽链终止包括：
❶RF根据对终止密码子的识别而结合到核糖体上；
❷结合在核糖体上的肽基tRNA的水解，所以RF3的促进作用或涉及其中一项或对这两项都有影响。目前资料提示，RF3可能影响密码子的识别。在无RF3时，RF2对UAA和UGA的Km分别为8.3×10-⁵M和5.6×10-⁵M，而加入RF3后RF2对这两个密码子的Km都降到1.3×10-⁵M而不影响水解的最大速度 (Vmax)。用放射性标记的终止密码子来定量RF1或RF2-[³H]UAA-核糖体中间体的形成，证明RF3促进RF1或RF2和核糖体的结合，参加到中间体，而当加入GTP或GDP则中间体解缔，RF3也同时脱下。
网织红细胞RF经采用葡聚糖G200层析法和平衡沉降法测定，分子量约为115,000; 以蔗糖梯度分析及SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测得分子量只为56,000，提示该RF以二聚体形式存在。RF与核糖体的结合能力亦可采用类似上述应用于RF1或RF2的方法进行；经证明单独一种RF识别所有三种终止密码子。测量RF-[³H]-UAAA-核糖体复合体单独存在和分别加入无 [³H]的UAAA、UAGA或UGAA的数据，发现所有这些寡核苷酸都有竞争作用，表明与[³H]UAAA结合的RF也能识别UAGA和UGAA。哺乳类的肽链终止受GTP促进，但为GDPCP所抑制，提示GTP的γ磷酸的水解是必要的条件。已经证实，高度纯化的网织红细胞RF具有依赖核糖体的GTP酶活性。这种活性不见之于单独存在的RF或核糖体，它为含终止密码子寡核苷酸UAAA所促进，但AAAA则无这种促进作用，提示GTP的水解还是和终止密码子的识别有关。由于GTP的水解可在不带肽基tRNA的核糖体上出现，而且抑制肽基tRNA水解的抗生素对此并无抑制作用，所以GTP的水解似与肽基tRNA的水解不相干。
肽链终止作用要求具有活性的核糖体 （即可以形成肽键的核糖体）的参加，实验证明50s亚单位是肽基tRNA水解所需，并提示肽基转移酶催化这一反应。氯霉素和稀疏霉素平行地抑制fMet的释放和肽基转移酶。稀疏霉素和茴香霉素同样抑制哺乳动物的肽基转移酶和由RF介导的肽基tRNA水解。结合到大肠杆菌核糖体或网织红细胞核糖体的甲酰[³H]Met-tRNA在乙醇作用下肽基转移酶可催化生成甲酰[³H]甲硫氨乙酯。如以丙酮代替乙醇，甲酰[3H]Met tRNA则水解。肽基转移酶十分可能参与肽链合成的终止。RF参加的机理，可能是RF上的亲核基团参加攻击作用并以共价键过渡性地接受新生的肽，或者RF只是改变肽基转移酶性质，使之催化水解作用。终止作用要求肽基tRNA位于可和嘌呤霉素相结合的P位上；有效抑制RF结合的链霉素和四环素也都抑制AA-tRNA的结合；表明释放因子要占据核糖体上的A位。除去了L7L12的核糖体再不能和RF1结合，表明L7L12参与核糖体对释放因子的识别作用。
终止作用反应步骤可示如图。完整的肽从核糖体释放后，在核糖体上还滞留着mRNA和空载tRNA在P位上。它们都要脱落下，一个分子量为18,000的核糖体释放因子帮助mRNA从核糖体上释放下来。核糖体也解缔为亚单位。

终止作用反应步骤示意图
Ⅰ，移位后，肽基tRNA在P位； Ⅱ,RF应答终止密码子，而和核糖体结合；Ⅲ，肽基tRNA水解，涉及RF和肽基转移酶的相互作用；Ⅳ, RF也从核糖体脱落。

新合成的多肽常要经过诸如水解断开、侧链修饰、二硫键形成和亚基聚合等处理才形成有活性的蛋白质，有些处理不待多肽从核糖体上脱下就进行。原核细胞常需切去N端甲酰甲硫氨酸，真核细胞的分泌蛋白质和膜蛋白的N端信号肽常要切去。真核细胞mRNA是单顺反子，为一条多肽编码，但有些多肽在合成后可水解成几种活性产品。例如，促肾上腺皮质激素，促黑激素和内啡肽就是从同一条多肽水解而成的。不少蛋白质在合成后要糖基化、磷酸化、甲基化或羟化等修饰。