维生素的测定determination of vitamin

对农作物及果、蔬类收获物等样品中的一类生物必需的微量有机活性物质进行定量分析的过程。1911年冯克(Funk)从米糠中分离出一种能治脚气病的结晶物质，取名Vitamine。后来将许多种因缺乏而致病的生长要素，统称为Vitamin类，译为“维他命”，后改称“维生素”。按其溶解性可以分为脂溶性(如维生素A、维生素D和维生素E等)和水溶性(如维生素B₁、维生素B₂和维生素C等)两大类。除少数几种维生素可在人体内合成外，大多数维生素都必须由食物中摄取。因此，测定植物及收获物中的维生素含量对评定其营养品质，探讨其贮藏与加工的科学性等具有很重要的意义。维生素的测定是一项较为复杂的工作，样品分析的一般程序是：❶用酸、碱或酶分解样品，使其中的维生素游离出来。
❷用溶剂进行提取。
❸分离干扰物质，对样液进行分离提纯。
❹选用适当的方法进行定量测定。早期的测定方法以动物学法为主，后来采用微生物法。由于微生物法对维生素具有较高的灵敏性，并且检出量低，因此，可用其与一些新发展的化学和仪器测定方法作对照试验。但微生物法麻烦费时；分光光度法比较简便和快速，但测定时的干扰因素较多；荧光法灵敏度高，对于几种具有特殊荧光反应的维生素则是最佳的方法；还有电化学法，放射性同位素，气相色谱法和高效液相色谱法等。其中以液相色谱法对维生素具有较高的分离效能，快速、简便、能同时测定多种维生素。
维生素C的测定 维生素C又称抗坏血酸(As-cordic acid)，有还原型(L-抗坏血酸)和脱氢型(L-脱氢抗坏血酸)。在一定的条件下，它们可以可逆地相互转化。测定方法多根据其还原性质为基础，一般有2,6-二氯靛酚滴定法，碘滴定法（适用于有色的样品测定液）,2,4-二硝基苯肼比色法和荧光分光光度法。其它还有高效液相色谱法。
2,6-二氮靛酚滴定法 应用还原型抗坏血酸能还原染料2,6-二氯靛酚的特性进行定量测定。该染料具有酸碱指示及氧化还原指示的两种特性。用蓝色染料标准溶液滴定植物样品酸性浸出液中维生素C到刚变浅红色为终点，由染料的用量即可计算维生素C的含量。此法适用于测定一般果蔬样品的还原型维生素C，不包括脱氢型维生素C。样品中如有Fe²⁺、Sn²⁺、Cu²⁺、SO₂等还原性杂质，则有干扰。
碘滴定法 用标准碘酸钾溶液滴定含抗坏血酸的酸性样品溶液，释放出来的碘可氧化抗坏血酸为脱氢抗坏血酸，以淀粉作指示剂，滴定至溶液呈蓝色不褪即为终点。根据消耗碘酸钾溶液的量即可计算样品中维生素C的含量。此法简便、快速，可准确测定有色样品溶液的还原型抗坏血酸。
2,4-二硝基苯肼比色法 总抗坏血酸包括还原型、脱氢型抗坏血酸和二酮古乐糖酸。用酸处理过的活性炭把还原型的抗坏血酸氧化为脱氢型的抗坏血酸，再继续氧化为二酮古乐糖酸。二酮古乐糖酸与2,4-二硝基苯肼偶联生成红色的脎。其呈色的强度与二酮古乐糖酸浓度成正比，可以比色定量。此法用于测定脱氢型维生素C以及维生素C的总量。
荧光分光光度法 用酸洗活性炭或2,6-二氯靛酚等氧化剂将还原型抗坏血酸氧化成脱氢抗坏血酸，然后与邻苯二胺缩合成荧光化合物（喹恶啉衍生物）。激发波长为350纳米，发射波长430纳米，其荧光强度与抗坏血酸成正比，由样品的荧光读数中减去空白，再与抗坏血酸标准样品荧光强度相比较，即可计算样品中抗坏血酸的总量。样品中其它荧光杂质的干扰可以通过向氧化后的样液中加入硼酸，使脱氢抗坏血酸不能与邻苯二胺生成荧光化合物，这样可以测出其它荧光杂质的空白荧光强度而加以校正。
维生素B₁的测定 维生素B₁又称硫胺素。通常使用的是它的盐酸盐。维生素B₁分子由一个嘧啶核及一个噻唑核组成。测定方法主要有荧光分光光度法和液相色谱法。其他方法有分光光度法、电化学法和薄层层析法。
荧光分光光度法的样品用稀酸提取，随后用磷酸酶或其他酶制剂将硫胺素从它的自然复合物中释出，提取液通过人造沸石柱纯化，硫胺素被吸附，其它杂质被除去。柱上的硫胺素用酸性氯化钾溶液洗脱，可被一些较温和的氧化剂[如K₃Fe(CN)₆、CNBr、Hg₂Cl₂等]氧化成一种蓝色荧光物质——硫色素(thiochrome)。在荧光计上，选用365纳米为激发波长，435纳米为发射波长，测定空白溶液、标准溶液与样品溶液的荧光强度。从而计算样品中维生素B₁的含量。此法灵敏度高，故常采用。
维生素B₂的测定 维生素B₂又称核黄素。为6,7-二甲基-(9-D-核糖基)-异咯嗪。它的水溶液具有黄绿色的荧光。在碱性溶液中受光线的照射很快转化为光黄素。光黄素的荧光较维生素B₂本身的荧光要强得多。这一性质是荧光法测定核黄素含量的基础。维生素B2的测定方法，多采用荧光分光光度法和液相色谱法。
荧光分光光度法 样品经稀酸溶液提取，除去蛋白质等物质，经高锰酸钾氧化，除去其它色素和荧光杂质等干扰物质，再经硅镁吸附剂的柱层析，用洗脱剂洗脱被吸附的维生素B₂。然后选用激发波长440纳米，发射波长525纳米，测定洗脱溶液中维生素B₂的荧光强度。再加低亚硫酸钠还原核黄素，测定残余荧光杂质的荧光强度，即为空白值。由还原前后的荧光差数与内标核黄素溶液荧光强度比较，即可测定样品中维生素B2的含量。也可采用光黄素荧光法，使维生素B₂在碱性溶液中经紫外线照射，进行光解而转化成光黄素，用氯仿提取，测定其荧光强度。此法的灵敏度和精确度都比前法好。
液相色谱法 样品经稀盐酸溶液提取，使用淀粉酶和木瓜酶分解样液中的淀粉和蛋白质，在碱性铁氰化钾溶液中氧化后用异丁醇提取，有机相通过无水硫酸钠小柱，然后用YWG-C₁₈柱，乙腈—磷酸盐缓冲溶液作流动相，以荧光检测器进行液相色谱法分别测定维生素B₁和维生素B₂。