组织培养繁殖propagation by tissueculture

在人工培养基中，使离体组织细胞培养成为完整植株的繁殖方法。属于微体繁殖的一种， 因开始应用的培养容器多是试管， 又称试管繁殖或试管育苗。果树的组织培养材料是植株离体材料，称外植体。根据所使用的不同外植体可分为几种培养方式。用顶端分生组织及其下的第1～2个叶原基切离培养的， 称茎尖培养；以小段成熟枝条进行培养的称茎段培养；以叶片或叶鞘组织进行培养的， 称叶片培养； 还有胚培养等。
利用组织培养方法繁殖果树植株具有占地面积小，繁殖周期短，全年都能进行繁殖， 繁殖系数高等特点。而且， 还可以消除果树的某些病毒病， 适应果树向品种更新快、矮化密植以及无病毒栽培方向发展的需要。但是目前果树的组织培养繁殖除了草莓的繁殖已进入实用阶段， 苹果，柑橘等已用于无病毒苗培养等外，其他木本果树还处于试验阶段， 有些已获成功。
概况 果树组织培养繁殖的研究， 始于20世纪40年代。法国G.Morel(1944)首先进行了葡萄茎尖组织培养的尝试， 获得了愈伤组织和根。美国Miller等(1963)通过茎尖培养获得了脱病毒的草莓苗。此后研究工作进展迅速，各国对柑橘、猕猴桃、扁桃、桃、樱桃、李、梨、苹果等树种进行了组织培养繁殖的研究， 并利用组织培养苗木建立了葡萄园、草莓园、苹果园等，及无毒苗木的繁殖。中国在这方面的研究起步较晚，但发展较快。已在苹果、葡萄、柑橘、草莓、猕猴桃、菠萝、枇杷等树种上开展了组培脱毒和苗木繁殖工作，建立了苹果、葡萄、草莓、猕猴桃等果树的组培苗木果园。组织培养的途径 G.Hussey(1977)将组织培养归纳为3种途径： ❶顶端分生组织培养。利用激素处理抑制顶端优势， 促成腋芽或不定芽发育成新梢。再切下分化的芽和新梢， 继续培养， 增加繁殖系数。将达到生根标准的新梢转接于生根培养基上， 使其发育成完整植株。这种繁殖途径变异少， 在实际应用中是比较理想的。
❷器官培养。采用果树的某种器官， 通过刺激使其不定分生组织发生芽或新梢。将长成的新梢转移于生根培养基上， 发育成完整植株。
❸愈伤组织的培养。对果树植物体的不定分生组织通过造伤、激素等各种刺激， 促使产生愈伤组织， 再使愈伤组织不断增生， 然后通过分化培养使之产生分生组织， 分化出芽， 长成新梢， 再作生根培养， 长成完整植株。但植株易发生变异， 在需要保持果树优良性状的繁殖中不宜采用， 但可用于诱变育种。
培养基 培养基是外植体赖以生长和发育的基质。适宜的培养基是达到培养目标的关键， 应根据不同树种、不同培养材料在各个生长和发育阶段中所需的营养来配制。常用的培养基有含盐种类较少， 盐量较低的White、Nitsch、Knop培养基；也有含盐种类较多，盐量较高的B5、B6、H·Ls及Ms等培养基。其中以Ms培养基应用较普遍，培养效果也较好， 它的主要成分包括N、P、K、Ca、Mg等大量元素和Mn、Zn、Cu、Co、B、I、Mo、Fe等微量元素、蔗糖及氨基酸、B族维生素、烟酸、肌醇等有机成分。培养基中加用6～8%的琼脂做凝固剂。此外， 为达到一定的培养目的，在Ms基本培养基中还须加入一些附加成分， 如水解酪蛋白（或水解乳蛋白）、植物激素。常用的植物激素有细胞分裂素， 如激动素(KT)、六苄基腺嘌呤(BA)、玉米素(Zi)等； 以及生长素， 如吲哚乙酸(IAA)、吲哚丁酸(IBA)、萘乙酸(NAA)及2,4-二氯苯氧乙酸 (2,4-D) 等；有的还加入赤霉素。对植物激素的应用， 在培养的前期（接种外植体阶段）为加速苗的分化， 应采用无或低浓度生长素， 而含有较高浓度细胞分裂素的分化培养基；在生根培养阶段，则宜采用含有生长素而无细胞分裂素的生根培养基。为了配制方便，常将培养基中各种成分依化学性质分组，先配成母液备用。用时以培养基用水量的一半左右与蔗糖和琼脂加热溶化，再加入相应量的母液， 最后加入定容。再用1摩尔NaOH或1摩尔HCl调整pH，使之达到pH 5.8或适宜的酸碱度。充分搅拌后装瓶。每个三角瓶装置以形成厚约1厘米的培养基层为宜， 装后尽快封盖， 在1个气压， 121℃下灭菌15～20分钟，灭菌后冷却到室温即可应用。
接种 常用的接种材料有茎尖、茎段、叶片等， 一年四季都可取摘、接种， 各季节的材料都能分化、出苗。其中以芽萌动前后取材接种的分化率最高， 分化新苗的生长速度也快。接种材料的大小， 因培养目的而不同， 为脱除繁殖材料的病毒， 应取0.1～0.2毫米的茎尖； 对一般繁殖材料，可取大茎尖或茎段培养，以提高分化率和分化速度。培养材料要求既不带菌， 又保持良好的生活力。为此， 一般要经过以下两个灭菌过程，先用湿润剂处理使杀菌剂能很好渗入培养材料，湿润剂有70～75%酒精等， 酒精兼有杀菌能力； 再选择灭菌快而彻底， 容易从材料上去除， 并对接种材料毒害作用小的药剂。不论以那种灭菌剂浸过的材料，都须用无菌清水冲洗3～5次， 除去残留药剂。之后在无菌操作台的条件下， 使用严格消毒过的针、刀， 剥离、切取材料， 并立即接种到培养基上， 注意不能把整个材料埋入培养基内。
繁殖培养 接种后的繁殖材料要求置于25～30℃恒温和1 500～3 000勒克斯(lx)光照强度， 每日光照16小时的条件下培养， 苗的分化速度较快， 分化苗的生长正常而迅速。每培养30～50天结合转换新鲜培养基进行一次分苗， 以扩大繁殖。分苗时掌握1厘米以上的苗， 每2～3节切为一段，1厘米以下的小苗每5～7节切为一块。分苗后有的树种如苹果无性系砧木和品种， 扩大繁殖的初期阶段， 应在暗培养中进行， 才可以加快繁殖速度。经暗培养2～3代后， 再转入光照培养， 以保苗势健壮。光照期间分苗主要是分块， 对高2厘米以上苗剪下进行生根培养， 余者5～7节切为一块，接入新培养基中继续繁殖。在进行茎段培养时，苗的分化、生长速度都较快， 应随时剪取高2厘米以上的分化苗的先端， 转入生根培养， 其余的切块转入新培养基继续繁殖（见图）。
生根培养 采用 1/2MS、1/2B₅、White、Knop等含盐量低的培养基。蔗糖的用量减为1/2或1/4。附加成分中， 一般不使用水解酪蛋白类物质和细胞分裂素， 主要使用生长素类， 如IAA、IBA、NAA等。多数单用一种生长素， 也有混加几种生长素的。使用方法， 有的把生长素加到培养基中， 直接接种绿苗； 有的先用高浓度生长素无菌溶液浸蘸绿苗基部， 经一段时间后再接种于生根培养基上； 也有将培养基所用的盐类和生长素配成营养液， 把够标准的绿苗基部浸于营养液中培养生根。生根培养期间的温度与扩大繁殖期间基本相同。而光照强度一般要求在2000勒克斯(lx)以上。
土壤培养 组培生根苗移栽到土壤时， 由于培养条件和外界条件差异很大， 影响成活率。一般茎基直接产生不定根， 根多而粗壮， 叶大、厚、色深绿的健壮生根苗， 移栽土壤的成活率普遍较高。弱苗， 特别是不定根发自茎基愈伤组织的， 则叶小苗弱， 很难成活。生根苗移出后， 先栽于洗净、灭菌的河沙中， 初期加盖烧杯或塑料罩，以保持较高的空气相对湿度。以后逐渐降低到外界水平。沙培期间只浇清水， 经2至3个星期后移栽于装有培养土的木箱或花盆中，再培养4～5个星期后，带土栽于田间，便可成活。此间要求光照强度稳定在2000勒克斯(1x)以上；气温控制在15～20℃, 沙培中沙的含水率保持在7～10%，空气相对湿度初期保持在80%以上， 以后逐渐降至50～60%, 土培中的土壤含水率在20%左右， 空气相对 度为50～70%。

组织培养繁殖

1. 剥取的M7腋芽生长点， 解剖镜下放大40倍； 2. 暗培养的M7, 接种后30天； 3. 暗培养的M26，接种后70天； 4. 富士品种，转入光照培养30天； 5.生根培养30天的圆叶海棠生根苗； 6. 沙培15天的M4苗； 7. 软枣猕猴桃生长点培养苗， 土培2个月； 8. 辽红山楂生长点培养苗，土培5个月； 9. M7苗， 土培10个月； 10. 生长点培养M4+富士苗， 定植当年开花状； 11. 生长点培养金矮生自根苗， 定植4年结果状； 12. 暗培养的M26, 分苗后20天。左： 分苗时保留愈伤组织， 右： 分苗时清除愈伤组织； 13. 光照培养的M26，分苗后30天。左： 分苗时清除愈伤组织，

右： 分苗时保留愈伤组织