紫外—可见分光光度法uv-vis-spectrophotometry

也叫紫外—可见吸收光谱法。是基于物质的分子对紫外—可见光具有选择吸收的特性建立起来的一种仪器分析方法。包括比色分析法和紫外—可见分光光度法。
原理 当光线通过某物质溶液时，光的强度由于该物质分子对光的选择吸收而减弱，减弱的程度与物质的性质、液层厚度、入射光波长有关。其定量关系为朗伯—比耳(Lambert-Beer)定律（亦称光的吸收定律）。即溶液的吸光度与溶液中有色物质的浓度和液层厚度的乘积成正比。其数学式为

式中 A为吸光度；I₀为入射光强度；I为透射光强度；L为光线通过有色溶液的液层厚度(cm);C为溶液中有色物质的浓度(摩尔/升);ε为摩尔吸光系数（或消光系数），单位为升·摩尔^-1·厘米^-1。摩尔吸光系数是每种吸光物质在一定波长下的特征常数，可用来衡量物质吸收光的灵敏度，ε值越大，该物质对光的吸收越强。
主要仪器 比色分析法如以肉眼观察比色管来比较溶液颜色的深浅以确定物质的含量，称为目视比色法。利用光电池和电流计来测量通过有色溶液的透射光强度，从而求得被测物质含量的方法叫做光电比色法。所用仪器称为光电比色计。它们的单色性差，常用玻璃滤光片，检测记录系统也较简单。这类仪器在农业部门使用很普通。分光光度法是利用单色器（棱镜或光栅）获得单色光(3～5纳米波带的宽度)来测定物质对光的吸收能力的方法，所用仪器称为分光光度计。下图为单波长单光束分光光度计的工作原理图，分光光度计有各种型号，但仪器的基本结构相似，都是由光源(可见光光源用白炽灯，紫外光源用氢弧灯)、单色器、吸收池(可见光用光学玻璃池，紫外光用石英质池)、检测器和显示器等主要部件组成。可见分光光度计和紫外分光光度计两种仪器的结构原理相同，设计时往往合并在一个仪器中统称为紫外—可见分光光度计。

单波长单光束分光光度计原理图

由光源发出的光束经单色器分离出单色光，该单色光通过参比吸收池后照射于光电倍增管或光电管上，并被转为光电信号，在显示装置上以透射率或吸光度的形式显示出来。调节单色器的狭缝宽度以改变入射光强度或调节仪器的电子放大装置，使显示装置上的吸光度为零或透射率为100%。然后把样品吸收池置于光路中，由显示装置读出样品的吸光度A。
按照仪器的显示装置，单波长分光光度计又可分为直读式、调零式和由微处理机控制及处理数据，并由打印机或绘图机给出结果等几种形式。此外，还有各种型号的双光束分光光度计。
特点及应用 与化学分析法相比较，该法具有以下特点：❶灵敏度高。一般测定下限可达10^-4%～10^-5%，适用于微量组分的测定。
❷准确度较高，能满足微量组分测定的要求。此法的相对误差为±2%～5%，若用精密仪器，误差可降至±1%～2%。
❸仪器设备比较简单。操作快速简便，费用较低。
❹应用广泛。可测元素众多，测定范围较广。由于这些特点，此法已成为仪器分析方法中广泛采用的方法之一。在微量元素分析、生物化学、农业化学等方面的工作中处于重要地位。
紫外—可见分光光度法主要用于无机物和有机物含量的测定。紫外分光光度计还可用于有机化合物的鉴定、有机异构物的判别以及有机化合物分子量的测定等方面。在农业化学分析中此法常用于农产品品质分析，动植物生理生化测定，土壤、肥料和植株的分析。例如土壤、肥料和植株中氮、磷、钾、腐殖质、蛋白质、淀粉、可溶性糖、维生素C和铁、锰、铜、锌、硼等元素的分析以及根系活力和多种酶活性的测定。
进展 近年来，人们对提高分光光度法的灵敏度作了深入的研究。例如寻求高灵敏度试剂，利用动力学反应，应用共沉淀、萃取、色谱、离子交换等分离方法进行预浓集，并对仪器进行改进等，都使灵敏度大为提高。尤其是应用离子缔合络合物，常可使摩尔吸光系数提高到105以上。同时，寻求高选择性试剂，应用掩蔽剂消除干扰，可使分光光度法的选择性得到进一步提高。采用双波长分光光度计，可以在某些元素存在下，不经分离而对某一微量元素进行测定。采用二极管阵列分光光度计，可使吸收光谱的扫描在瞬间完成。