相差显微镜phase-contrast microscope

将光线通过透明细节时所产生的光程差（相位差）转化为光强差的特种显微镜，亦称相衬显微镜，相位显微镜。荷兰物理学家泽尔尼克(F.Zernik)于1934～1935年发明，被授予1953年诺贝尔物理学奖。
基本原理 A点是透明标本中折射率或厚度与背景不同的透明细节，由于光线经过样品时的光程与细节的折射率及厚度有关(光程=折射率×厚度)，如经过细节的光线与经过背景的光线在光程上不一致，便会发生衍射现象，使经过细节A点的光线形成两支：直射光a和方向偏转的衍射光a′，前者光线很强，后者很弱，两者在光程上差1/4波长，a光和a′先叠加后成像于A′。在普通光学显微镜，由于a′光很弱，且a光与a′光在相位上仅差1/4波长，故两支光叠加后不明显削弱，即像A′的亮度与背景相似，难以分辨。在相差显微镜，通过特殊装置分别对直射光和衍射光作了特殊处理：将直射光a的光强减弱到与衍射光a′相似，且让a′再滞后1/4波长，这样，a与a′由于光强相同，相位差1/2波长，叠加后A′为暗点，而背景由于只有直射光，因此是亮点，即细节A可与背景相分辨(图1)。这些特殊装置位于聚光镜前焦平面的环状光阑和物镜后焦平面的相板之间。根据显微镜的成像原理，环状光阑恰好成像于物镜的后焦平面上，即来自环状光阑通过标本后的直射光全部通过物镜后焦平面的一个环状区域，而衍射光由于发生偏向，大多经过除环形的共轭区以外的区域。因此，只要在相板上直射光经过的环形区域涂上一层金属吸收膜，再在衍射光经过的区域涂上一层电介质膜以推迟相位，便可达到对直射光和衍射光分别进行特殊处理的目的。

图 1 相差显微镜原理

1. 环状光阑位置； 2. 聚光镜；3. 样品； 4. 物镜；5. 相板位置； 6. 实像平面； 7. 相板； 8. 环状光阑；A.B.细节； A′B′细节A的放大实像

结构 基本构造与普通光学显微镜相似，其特点是配备有环状光阑、相板及合轴调节用的中心望远镜。
环状光阑 具有环形开孔的光阑，位于聚光镜的前焦平面上，其直径常随物镜放大倍率的高低而大小不一，故常与聚光镜一起组成转盘聚光器。同一转盘聚光器内有与10×、20×、40×、100×四种物镜相匹配的四个环状光阑和一个普通明视野光阑。在使用时只要把相应的光阑转到光路即可。
相板 位于物镜内部的后焦平面上，涂有吸收膜及电介质膜。带有相板的物镜称相差物镜，以Ph表示。相板上有两个区域，即直射光经过的共轭面和衍射光经过的补偿面。吸收膜涂在共轭面上以吸收减弱直射光的相板称A相板； 涂在补偿面上以吸收衍射光的称B相板。电介质膜涂在补偿面上以推迟衍射光的相位称暗反衬或正反衬，用DP或+表示，电介质膜涂在共轭面上，推迟直射光的相位称明反衬或负反衬，用BN或-表示。故相板可有A+、A-、B+、B-四种。一般观察半透明标本或染色体以暗反衬较好； 研究活细胞的细微结构及运动以明反衬为好； 如观察重叠的细胞，B-相板可以消除细胞周围的亮缘。
中心望远镜 环状光阑的像必须重合于相板的共轭面才能实现对直射光和衍射光的特殊处理，由于环状光阑是通过转动转盘聚光器与物镜相匹配的，因而环状光阑与相板常不同轴。为此，相差显微镜配备有一个中心望远镜用于合轴调节，使用时拔去一侧目镜，插入中心望远镜，调节中心望远镜的焦点使之可以看到一明一暗两个环，再转动环状光阑周围的调节钮，使明暗两环重叠，最后取下中心望远镜，换上目镜即可观察。
应用 相差显微镜能观察到透明样品的细节，因此适用于对活细胞生活状态下的生长、运动、增殖情况及细微结构的观察，是细胞生物学，细胞和组织培养，细胞工程、杂交瘤技术等现代生物学研究的必备工具，结合显微缩时摄影技术，相差显微镜大大丰富了人类对活细胞的运动、分裂及衰老等过程的了解。通过改变已知折射率的基质，可以对细节及活细胞进行折射率测定，这是现有最灵敏的显微折射测定术之一。
干涉相差显微镜是将被检样品细节的相位差转化为明暗及色泽差别的特殊显微镜。相差显微镜是将光线经过细节产生的衍射光和直射光经过特殊处理再叠加在一起，产生细节与背景间的明暗对比，干涉显微镜则是将穿过透明标本细节的光线与另一条发自同一光源但未穿过该细节的光线发生干涉，由于通过不同细节的光线光程不一，因此经过干涉后便可在不同细节间观察到明暗或色泽的对比。
干涉显微镜曾由于设计及制造上的困难而使应用受到限制。照明光经偏振片成偏振光，通过方解石将每一光线分成e光和o光两束，分别穿过标本的不同区域，再经另一方解石将两支光又合成一束，最后用另一偏振片将两束光合成的光线转换到相同的偏振方向而产生干涉(图2)。

图 2 干涉相差显微镜原理示意图

干涉显微镜能用于透明样品的观察，其优点是能消除相差显微镜观察时常见的细节光晕。同时，细节间不仅具有明暗对比而且还具有色泽对比，并有一定程度的立体感，观察效果优于相差显微镜。此外，干涉显微镜还可用于细节干重的测量。

相差显微镜phasecontrast microscope

利用光波衍射和干涉原理，使光线通过无色透明物体时，产生的光程差（或相位差）转变为光强差的特种显微镜。它是利用环形光阑和物镜上环形相板来达到的。前者产生的环形光束入射到标本后，只有直接光进入相板的环形区域，而衍射光则全面扩散，两者得以分开，并设法改变其相位和亮度关系。当两者相位相同时，像比背景更亮成为明反差；当两者相位相差180°时，像比背景更暗，成为暗反差。适用于活细胞无色透明样品的观察和对不能染色或不应该染色的薄样品的观察。

相差显微镜

相差显微镜是利用组织结构密度的不同而对光折射率的差异进行检查，使肉眼不能分辨的相差变为可分辨的振幅差，也就是使无色透明的物体，在相差镜下呈现为清晰的明或暗的反差强的图象。
光的波长决定可见的各种色彩，振幅决定光的亮度。一般活体组织结构是无色透明的。各结构的密度不同，光通过时速度减小而产生相位差。在普通显微镜下，相位差异不能识别，因亮度并无变化不能观察结构的细节。相差显微镜是利用光线通过被检物体发生不同程度的偏斜，产生衍射光而与物体周围的直射光之间的相位差异而设计的。
在普通显微镜下，被检物体的折射率比周围大，因而相位被推迟，这物体的衍射光比直射光的速度推迟1/4波长(图中A)。衍射光a和直射光b会聚成合成波c，但它的振幅与直射光的差异不大，因而物体与周围背景没有形成明暗反差，检查时不易分辨出物体的结构。相差显微镜在物镜焦点平面上插入一个相差板。它能使衍射光和直射光分别通过不同的区域，并在板上各区域镀上不同物体，使物体的衍射光或直射光速度减慢，使两者相位一致或只差1/2，则合成波的振幅因光的干涉原理而变强或变弱，与物体周围直射光成为亮度反差强的对比，物体的形象则清晰可见。当把直射光的速度推迟1/4波长，直射光a与衍射光b的相位一致，则合成波c的振幅增大(图中B)而产生明反差，即物体比周围背景明亮。如把衍射光推迟1/4波长，则衍射光b与直射光a的相位差1/2波长，合成波c的振幅只是两者的差数(图中C)，而产生暗反差，即物体的成象要比周围背景暗。

直射光和衍射光的干涉

A.衍射光比直射光推迟1/4波长，由二者干涉形成的合成波的振幅与直射光的振幅相同，相位稍推迟，光的明暗度无明显变化。B.把直射光推迟1/4波长，使它与衍射光的振幅相同，合成波的振幅增大，光增强 C.在A的基础上，再推迟衍射光1/4波长，使它与直射光相差1/2波长，合成波的振幅变小，光变暗

相差显微镜应用在活体观察，并可在镜下连续拍摄记录体外培养的细胞或胚泡的生活活动，如细胞分裂，受精，卵裂，神经组织，血管再生等生命现象。电子显微镜所用的标本，利用相差显微镜检查半超薄切片，可初步了解并定位所要进行电镜检查的组织结构，因而它是电镜技术不可缺少的工具。

相差显微镜phase contrast microscope

在检查未染色标本时，细菌的折光性与周围环境的折光性相近，用普通显微境不易看清，用暗视野映光法也只能看到发亮的细菌轮廓，看不清内部结构。相差显微镜可弥补这两种镜检法之不足。其原理主要是光线经标本中密度不同的部位时，可引起光相的差异。相差显微镜就利用一块相差板的光栅作用，改变直射光的光相和振幅，把光相的差异转换成光的强度差异，使细菌中的某部分结构表现得比其他部分深暗，衬托出鲜明的对比。主要运用于不染色活菌的形态与某些内部结构的检测。